HIF－1信號通路在介導(dǎo)DMOG動員MSCs中的作用

研究報告

HIF-1信號通路在介導(dǎo)DMOG動員MSCs中的作用

胡韶君1，余勤1，劉麗珍2，葛婷婷1

(1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310053；

2．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，杭州310003)

【摘要】目的探討HIF-1及下游SDF-1α/CXCR4和VEGF/VEGFR 通路在介導(dǎo)DMOG動員MSCs中的作用機(jī)制。 方法 將雄性SD大鼠，隨機(jī)分為五組：生理鹽水對照組、DMOG組、YC-1組、AMD3100組、SU5416組。分別采用CFU-F法與流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠骨髓和外周血中MSCs的數(shù)量；ELISA法檢測骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF蛋白濃度；Western blotting法檢測骨髓細(xì)胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 同NS組比較，DMOG組CFU-Fs 數(shù)量顯著增加，且CD45-CD90+細(xì)胞群比例增加(P < 0.05)；同DMOG組比較，YC-1組、AMD3100組、SU5416組CFU-Fs數(shù)量均顯著減少，且CD45-CD90+細(xì)胞群比例降低(P < 0.05)；同DMOG組比較，YC-1組HIF-1α濃度及蛋白表達(dá)顯著降低(P < 0.05)，AMD3100組SDF-1α濃度及蛋白表達(dá)顯著降低(P < 0.05)，SU5416組VEGF濃度及蛋白表達(dá)顯著降低(P < 0.05)。 結(jié)論 DMOG可能通過上調(diào)HIF-1α，從而調(diào)控其下游SDF-1α/CXCR4通路與VEGF/VEGFR通路誘導(dǎo)MSCs 的動員。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞動員；DMOG；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-lα；血管內(nèi)皮生長因子

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(81270566)；教育部高校博士點(diǎn)專項科研基金(20130101120022)。

[作者簡介]胡韶君(1989-)，碩士，研究方向：干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究。

[通訊作者]余勤(1962-)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail: qinyu3587@aliyun.com。

【中圖分類號】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.002

Mechanism of HIF-1 signaling pathway in mediating

MSCs mobilization with DMOG

HU Shao-jun1，YU Qin1，LIU Li-zhen2，GE Ting-ting1

(1. College of Life Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;

2. Bone Marrow Transplantation Center, The First Affiliate Hospital, Medical School of Zhejiang University,

Hangzhou 310003, China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the role of HIF-1 and its downstream SDF-1α/CXCR4 and VEGF/VEGFR pathway in mediating MSC mobilization with DMOG. Methods Male SD rats were randomly divided into five groups: Normal saline control group, DMOG group, YC-1 group, AMD3100 group, SU5416 group. We used CFU-F assay and flow cytometry to determine the number of MSCs in rat bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) in each group, respectively. The concentrations of SDF-1α and VEGF both in BM and PB serum in each group were detected by ELISA. Western blotting was used to test protein levels of HIF-1α, SDF-1α and VEGF in BM. ResultsCompared with NS group, the number of CFU-Fs as well as the percentage of CD45-CD90+cells increased in DMOG group (P < 0.05); Compared with DMOG group, the number of CFU-Fs as well as the percentage of CD45-CD90+cells decreased in YC-1 group, AMD3100 group and SU5416 group (P < 0.05). Compared with DMOG group, the concentration and protein expression of HIF-1α decreased significantly in YC-1 group (P < 0.05), the concentration and protein expression of SDF-1α decreased significantly in AMD3100 group (P < 0.05), the concentration and protein expression of VEGF decreased significantly in SU5416 group (P < 0.05). Conclusion DMOG can induce MSCs mobilization possibly via up-regulating the expression of HIF-1α and activating its downstream SDF-1α/CXCR4 and VEGF/VEGFR pathway.

【Key words】Mesenchymal stem cells mobilization；DMOG；Hypoxia inducible factor-1α；Stromalcell-derived factor-lα；Vascular endothelial growth factor

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)動員指應(yīng)用動員劑或采用動員措施促使骨髓中MSCs釋放并遷移到外周血[1]。在組織損傷需要MSCs參與修復(fù)的第一時間，給予動員措施，MSCs即可在短時間內(nèi)從骨髓進(jìn)入循環(huán)池，遷移、歸巢入損傷部位，參與損傷修復(fù)，此舉具有體外細(xì)胞移植修復(fù)損傷無法比擬的低創(chuàng)性和高效性，因此MSCs動員方法及其機(jī)制的研究具有重要的臨床意義[1-3]。但是，目前尚缺乏臨床可行的MSCs 動員措施，動員機(jī)制也不明確。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸羥化酶抑制劑—二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxaloylglycine，DMOG)對小鼠MSCs具有動員作用[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor -1α，HIF-1α)是缺氧誘導(dǎo)MSCs動員的關(guān)鍵因子，在MSCs動員過程中起中心作用[5]。HIF-1直接調(diào)控的下游信號基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)/CXC族細(xì)胞因子受體4(CXCR4)通路與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)通路在干細(xì)胞動員與MSCs遷移中起重要作用[6]。

本研究通過給予HIF-1拮抗劑YC-1下調(diào)HIF-1的表達(dá)，CXCR4拮抗劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4通路，VEGFR拮抗劑SU5416阻斷VEFG/VEGFR 通路，探討HIF-1及下游SDF-1α/CXCR4通路和VEGF/VEGFR通路在DMOG誘導(dǎo)MSCs動員中的作用機(jī)制。研究結(jié)果將為MSCs動員劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物

清潔級SD大鼠，4周齡，80±10 g，雄性，來源于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2008-0016】。實驗在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進(jìn)行【SYXK(浙)2008-0115】。

1.2主要試劑與儀器

藥品及主要試劑：DMOG(Cayman公司)；YC-1、AMD3100、SU5416(Sigma公司)；兔抗大鼠CD45-FITC抗體、兔抗大鼠CD90-PE抗體、熒光同型對照抗體、兔抗大鼠HIF-1α抗體、兔抗大鼠SDF-1α抗體、兔抗大鼠VEGF抗體、兔抗大鼠GAPDH抗體、山羊抗兔二抗(Abcam公司)；DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基(Invitrogen產(chǎn)品)；胎牛血清(FBS，Gibco產(chǎn)品)；紅細(xì)胞裂解液(北京鼎國生物科技公司)、大鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；分子生物學(xué)實驗常用試劑(Sigma公司)；SDF-1α、VEGF ELISA檢測試劑盒(RayBiotech公司)。

主要儀器：SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀(MD公司)；FC500MCL型流式細(xì)胞儀(BectonDiekinson公司)；Mini PROTEAN型垂直電泳槽、1703940 型半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-RAD公司)等。

1.3實驗分組

雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：①生理鹽水對照組(NS)：給予相同體積的生理鹽水；②DMOG組：腹腔注射DMOG 40 mg/kg；③YC-1組：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，YC-1 10 mg/kg；④AMD3100組：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，AMD3100 5 mg/kg；⑤SU5416組：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，SU5416 5 mg/kg。每組5只，連續(xù)給藥7 d。

1.4大鼠骨髓及外周血單個核細(xì)胞提取

各處理組連續(xù)給藥7 d后，無菌條件下取出大鼠股骨和脛骨，剔除肌肉、脂肪等，PBS沖出骨髓單個核細(xì)胞(bonemarrow mononuclear cells，BMMNCs)，1000 r/min離心5 min，棄去上清，按1:2加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min，1000 r/min離心5 min，重懸計數(shù)；10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，無菌條件下，10 mL注射器取腹腔動脈血5 mL，緩慢加入含5 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000 r/min離心20 min，吸取白霧層，PBS洗滌2次后，重懸計數(shù)外周血單個核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMNCs)。

1.5大鼠骨髓及外周血中MSCs數(shù)量檢測

將計數(shù)后BMMNCs及PBMNCs以3×106cells/mL重懸于含有20% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后換新鮮培養(yǎng)基，以后每3 d換液一次，培養(yǎng)14 d后，顯微鏡下觀察計數(shù)骨髓CFU-Fs(將呈成纖維樣生長，且細(xì)胞密度大于50個細(xì)胞的集落標(biāo)記為1個CFU-F)與外周血CFU-Fs。CFU-Fs數(shù)量即為骨髓與外周血中MSCs數(shù)量。

1.6大鼠骨髓及外周血中CD45-CD90+細(xì)胞群比例檢測

將1×105個BMMNCs及PBMNCs分別重懸于含100 μL PBS的流式管中，并設(shè)置單色及雙色同型對照組。每管細(xì)胞加2 μL兔抗大鼠 CD45-FITC抗體及5 μL兔抗大鼠CD90-PE抗體。室溫避光條件孵育30 min后，PBS洗去未結(jié)合抗體，流式細(xì)胞儀檢測CD45-CD90+細(xì)胞群比例。

1.7骨髓上清及外周血清中SDF-1α、VEGF濃度檢測

各處理組連續(xù)給藥7 d后，無菌條件下取各組大鼠外周血、股骨及脛骨，方法如1.4。PBS沖出BMMNCs，4℃，1000 r/min離心10 min，收集骨髓上清；取各組大鼠外周血5 mL，4℃，1000 r/min離心20 min，收集外周血血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)檢測SDF-1α、VEGF濃度，具體過程按照試劑盒說明書操作。

1.8HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表達(dá)檢測

取各組大鼠BMMNCs，方法如1.4。收集各組大鼠BMMNCs至1.5 mL EP管中，加200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解樣本5 min，充分裂解后，4℃，12000 r/min離心20 min，保留上清。馬斯藍(lán)染色法測定各組蛋白總量，將各組蛋白濃度稀釋至5 μg/μL。SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加兔抗大鼠HIF-1α抗體、兔抗大鼠SDF-1α抗體、兔抗大鼠VEGF抗體、兔抗大鼠GAPDH抗體(HIF-1α稀釋度1∶1000，SDF-1α稀釋度1∶1000，VEGF稀釋度1∶1000，GAPDH稀釋度1∶2000，4℃孵育過夜，洗膜液漂洗3次，加山羊抗兔二抗(稀釋度1∶2000)室溫孵育1 h，洗膜液漂洗3次，ECL顯影，待膠片出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，拍照，用Image J軟件進(jìn)行吸光度分析，測出各組樣本蛋白相對表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1CFU-F法與流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠骨髓及外周血中MSCs數(shù)量

CFU-F法結(jié)果顯示：DMOG組大鼠骨髓及外周血CFU-Fs數(shù)量較NS組顯著增加(13.4±1.14VS 9.2±0.83；2.6±0.54VS 1.4±0.54，P< 0.05)。YC-1、AMD3100、SU5416組骨髓CFU-Fs數(shù)量較DMOG組顯著降低(9.8±0.83、10.4±1.14、9.6±1.14 VS 13.4±1.14，P< 0.05)，同時外周血CFU-Fs 數(shù)量也顯著降低(1.2±0.83、1.6±0.54、1.6±0.54 VS 2.6±0.54，P< 0.05)(表1)。

表1　骨髓及外周血中CFU-Fs數(shù)量

注：與NS組比較，#P< 0.05；與DMOG組比較，*P<0.05。

Note: Compared with NS group,#P<0.05; compared with DMOG group,*P<0.05.

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：DMOG組骨髓與外周血中CD45-CD90+細(xì)胞群比例與NS組比較明顯升高(3.67±0.17% VS 2.94±0.06%，15.3±0.33% VS 6.37±0.23%，P< 0.05)。YC-1、AMD3100、SU5416組骨髓與外周血中CD45-CD90+細(xì)胞群比例與DMOG組比較顯著降低(2.52±0.05%、2.55±0.10%、2.48±0.07% VS 3.67±0.17%；12.6±0.31%、13.1±0.55%、11.6±0.53% VS 15.3±0.33%，P< 0.05)(彩插2圖1)。

2.2ELISA檢測大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α，VEGF 濃度

ELISA檢測結(jié)果顯示：DMOG組處理7 d后，大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α、VEGF濃度與NS組相比顯著升高(P< 0.05)。AMD3100處理組大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α濃度同DMOG相比顯著降低(P< 0.05)。SU5416處理組大鼠骨髓上清及外周血清中VEGF濃度同DMOG相比顯著降低(P< 0.05)(圖2)。

注：A，骨髓上清SDF-1α濃度；B，骨髓上清中VEGF濃度；C，外周血清中SDF-1α濃度； D，外周血清中VEGF濃度。與NS組比較， *P<0.05。與DMOG組比較， #P<0.05。 圖2　骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF濃度 Note：A, SDF-1α concentration in BM serum；B, VEGF concentration in BM serum；C, SDF-1α concentration in PB serum； D, VEGF concentration in PM serum. Compared with NS group， *P<0.05. Compared with DMOG group， #P<0.05. Fig.2　Quantification of SDF-1αand VEGF concentrations in BM and PB

2.3Western blotting法檢測大鼠骨髓細(xì)胞中HIF-1α，SDF-1α，VEGF的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，HIF-1α、SDF-1α、VEGF 表達(dá)在給予DMOG后明顯增加(P< 0.05)。 YC-1組HIF-1α表達(dá)較DMOG組明顯降低(P< 0.05)。AMD3100組SDF-1α表達(dá)較DMOG組明顯降低(P< 0.05)。SU5416組VEGF表達(dá)較DMOG組顯著降低(圖3)。

注：A，各組大鼠骨髓細(xì)胞HIF-1α、SDF-1α、VEGF的表達(dá)水平；B、C、D：分別為HIF-1α、SDF-1α、 VEGF相對表達(dá)定量結(jié)果。與NS組比較， *P < 0.05。與DMOG 組比較， #P < 0.05。 圖3　骨髓細(xì)胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平 Note：A:The expression level of HIF-1α, SDF-1α and VEGF in BM cells; B, C, D：Relative levels of HIF-1α, SDF-1α and VEGF proteins were presented as the fold increase normalized to NS. Compared with NS group, *P < 0.05. Compared with DMOG group, #P < 0.05. Fig.3　The protein expression of HIF-1α, SDF-1α and VEGF

3討論

MSCs動員方法及其機(jī)制的研究具有重要的臨床意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸羥化酶抑制劑—DMOG對小鼠MSCs具有動員作用[4]，然而其潛在機(jī)制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸羥化酶在HIF-1的調(diào)控中有至關(guān)重要的作用，因而被認(rèn)為是體內(nèi)的氧感受器[7]。HIF-1α是脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase, PHD)唯一的底物。脯氨酸羥化酶抑制劑(PHD inhibitor，PHI)通過抑制PHD的活性，而抑制HIF-1α的羥化，減少常氧狀態(tài)下HIF-1α的降解，從而穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)，上調(diào)HIF-1信號通路。DMOG為酮戊二酸類似物，通過與內(nèi)源性的2-酮戊二酸競爭從而抑制脯氨酸羥化酶，是當(dāng)前脯氨酸羥化酶抑制劑研究的熱點(diǎn)[8-9]。在本研究中，我們采用CFU-F法和流式細(xì)胞術(shù)定量檢測骨髓及外周血中MSCs的數(shù)量，結(jié)果顯示DMOG組骨髓與外周血MSCs數(shù)量較NS組顯著增加，CD45-CD90+細(xì)胞群比例與NS組比明顯升高，驗證了DMOG對MSCs的動員作用。

HIF-1由HIF-1α及HIF-1β兩個亞基構(gòu)成，HIF-1β為HIF-1的構(gòu)成性亞基，在細(xì)胞漿中穩(wěn)定表達(dá)；HIF-1α為HIF-1的調(diào)節(jié)性亞基。YC-1作為靶向HIF-1α抑制劑，可以有效抑制動物體內(nèi)HIF-1α的表達(dá)[10-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YC-1可以明顯抑制HIF-1α上調(diào)。抑制HIF-1通路后，YC-1組的MSCs動員效率明顯降低，且SDF-1α濃度及蛋白表達(dá)顯著降低，表明HIF-1α在DMOG誘導(dǎo)的MSCs動員中起重要作用。研究證實，SDF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞受轉(zhuǎn)錄因子HIF-1直接調(diào)控。CXCR4是目前所知的SDF-1α的唯一受體。同時國內(nèi)外研究與我們前期研究均發(fā)現(xiàn)SDF-1α/CXCR4通路在MSCs遷移中發(fā)揮重要作用[5]。AMD3100是SDF-1α受體CXCR4的阻斷劑，能競爭性地結(jié)合CXCR4，有效阻斷SDF-1α/CXCR4通路。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷SDF-1α/CXCR4通路后，AMD3100組MSCs動員效率明顯降低，且SDF-1α濃度及蛋白表達(dá)顯著降低。VEGF/VEGFR是介導(dǎo)骨髓微環(huán)境改變、促進(jìn)MSCs遷移的重要通路。VEGF是受HIF-1直接調(diào)控的細(xì)胞生長因子，可通過與其特異性受體VEGFR結(jié)合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)新生血管的形成、提高血管通透性[13]。SU5416是一種脂溶性小分子合成受體酪氨酸激酶抑制劑[14-15]，它通過與酪氨酸激酶受體內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合競爭性抑制ATP而發(fā)揮作用。本研究通過SU5416特異性阻斷VEGF/VEGFR通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs動員效率降低，且VEGF濃度及蛋白表達(dá)降低。既往研究證實，VEGF/VEGFR與SDF-1α/CXCR4通路存在一定的交互作用，VEGF可上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α及其受體CXCR4的表達(dá)，但并不影響SDF-1α向細(xì)胞外分泌[16-17]。本研究結(jié)果提示，SU5416抑制骨髓細(xì)胞VEGF表達(dá)的同時對SDF-1α蛋白表達(dá)也有一定的抑制作用，但骨髓上清中分泌型SDF-1α水平并沒有顯著變化。VEGF與SDF-1通路之間相互作用的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DMOG誘導(dǎo)MSCs動員可能的作用機(jī)制為：機(jī)體接受DMOG后，抑制HIF-1α的羥化，HIF-1信號上調(diào)，調(diào)控其下游基因SDF-1α、VEGF 表達(dá)增加，故DMOG可能通過上調(diào)HIF-1，從而調(diào)控其下游SDF-1α/CXCR4通路與VEGF/VEGFR 通路誘導(dǎo)MSCs 動員。

參考文獻(xiàn)：

[1]Levesque JP, Winkler IG, Larsen SR,etal. Mobilization of bone marrow-derived progenitors[M]. Handb Exp Pharmacol: Springer Berlin Heidelberg , 2007: 3-36.

[2]Mansilla E, Marin GH, Drago H,etal. Bloodstream cells phenotypically identical to human mesenchymal bone marrow stem cells circulate in large amounts under the influence of acute large skin damage: new evidence for their use in regenerative medicine[J]. Transplant Proc, 2006, 38(3): 967-969.

[3]Pitchford SC, Hahnel MJ, Jones CP,etal. Troubleshooting: Quantification of mobilization of progenitor cell subsets from bone marrow in vivo[J]. Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 61(2): 113-121.

[4]劉偉，余勤，劉麗珍，等．脯氨酸羥化酶抑制劑對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的動員作用[J]．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，37(12)：1371-1376．

[5]Liu LZ, Yu Q, Lin J,etal. Hypoxia-inducible factor-1α is essential for hypoxia-induced mesenchymal stem cell mobilization into the peripheral blood[J]. Stem Cells and Development, 2011, 20(11): 1961-1971.

[6]Chen CP, Lee MY, Huang JP,etal. Trafficking of multipotent mesenchymal stromal cells from maternal circulation through the placenta involves vascular endothelial growth factor receptor-1 and integrins[J]. Stem Cells, 2008, 26(2): 550-561.

[7]Demidenko ZN, Blagosklonny MV. The purpose of the HIF-1/PHD feedback loop: to limit mTOR-induced HIF-1α[J]. Cell Cycle, 2011, 10(10): 1557-1562.

[8]Bernhardt WM, Gottmann U, Doyon F,etal. Donor treatment with a PHD-inhibitor activating HIFs prevents graft injury and prolongs survival in an allogenic kidney transplant model[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(50): 21276-21281.

[9]Liu XB, Wang JA, Ogle ME,etal. Prolyl hydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine enhances mesenchymal stem cell survival[J]. Cell Biochem, 2009, 106(5): 903-11.

[10]Shin, DH, Kim, JH, Jung, YJ,etal. Preclinical evaluation of YC-1, a HIF inhibitor, for the prevention of tumor spreading[J]. Cancer Lett, 2007, 255(1):107-116.

[11]Yeo EJ, Chun YS, Cho YS,etal. YC-1: a potential anticancer drug targeting hypoxia-inducible factor 1[J]. Natl Cancer Inst, 2003, 95(7): 516-525.

[12]Pan SL, Guh JH, Peng, CY,etal. YC-1 [3- (5′-hydroxymethyl-2′-furyl) -1-benzyl indazole] inhibits endothelial cell functions induced by angiogenic factors in vitro and angiogenesis in vivo models[J]. Pharmacol Exp Ther, 2005, 314(1): 35-42.

[13]Fong GH. Regulation of angiogenesis by oxygen sensing mechanisms[J]. Mol Med, 2009, 87(6): 549-560.

[14]Mendel DB, Schreck RE, West DC,etal. The angiogenesis inhibitor SU5416 has long-lasting effects on vascular endothelial growth factor receptor phosphorylation and function[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(12): 4848-4858.

[15]Sukbuntherng J, Cropp G, Hannah A,etal. Pharmacokinetics and interspecies scaling of a novel VEGF receptor inhibitor, SU5416[J]. Pharm Pharmacol, 2001, 53(12): 1629-1636.

[16]Hong X, Jiang F, Kalkanis SN,etal. SDF-1 and CXCR4 are up-regulated by VEGF and contribute to glioma cell invasion[J]. Cancer Letters, 2006, 236(1): 39-45.

[17]David Z, Yevgeniy L, Li L,etal. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion[J]. Laboratory Investigation, 2006, 86 : 1221-1232.

〔修回日期〕2014-10-09