藍(lán)氏賈第鞭毛蟲診斷

技術(shù)方法

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲診斷

高正琴，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

【摘要】目的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲作為一種重要的人獸共患寄生蟲病賈第蟲病的病原，其對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量造成的潛在威脅不容忽視。本研究的目的是建立藍(lán)氏賈第鞭毛蟲快速診斷方法，并對(duì)17個(gè)生產(chǎn)廠家516批2562只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢查結(jié)果進(jìn)行分析。 方法用直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法，對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果在SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢出數(shù)量眾多的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊，鑒定出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因。直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法均能檢出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。17個(gè)生產(chǎn)廠家516批2562只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲陽性檢出率22.9%(586/2562)。 結(jié)論直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法具有高度的敏感性和特異性，可用于藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的快速診斷。17個(gè)生產(chǎn)廠家516批SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲檢查結(jié)果未能全部符合規(guī)定。

【關(guān)鍵詞】藍(lán)氏賈第鞭毛蟲；直接鏡檢；快速姬姆薩染色；多重PCR；SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；質(zhì)量分析

[基金項(xiàng)目]國家科技支撐課題(2013BAK11B01)。

[作者簡(jiǎn)介]高正琴(1976-)，女，副研究員，研究方向：病原生物學(xué)和快檢新技術(shù)研究。

[通訊作者]賀爭(zhēng)鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。

【中圖分類號(hào)】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.014

Diagnoses ofGiardialamblia

GAO Zheng-qin，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 10050, China)

Abstract【】ObjectiveGiardia lamblia is an important pathogen of zoonosis giardiasis, it poses a potential threat to the quality of SPF (specific pathogen-free) laboratory animals cannot be ignored. The aim of this study is to establish the method of rapid diagnosis of Giardia lamblia, and analyze the test results of 516 batches form 17 manufactures. Methods Direct microscopy, Giemsa-fast staining and multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) were applied to detect Giardia lamblia.ResultsNumerous of Giardia lamblia trophozoites and cysts were detected in SPF laboratory animals by using direct microscopy and Giemsa-fast staining, and multiplex PCR were performed to identify 18S rDNA, β-giardin, TPI and GDH genes of DNA extracted from these trophozoites and cysts identified Giardia lamblia. Direct microscopy, Giemsa-fast staining, and multiplex PCR methods can be used to detect Giardia lamblia. Of the 2562 SPF laboratory animals studied, 22.9% (586/2562) were positive for Giardia lamblia.ConclusionsDirect microscopy, Giemsa-fast staining, and multiplex PCR were effective techniques with high sensitivity and specificity for rapid diagnosis of Giardia lambliain. It is not satisfactory that the results of Giardia lamblia examination in 516 batches form 17 manufactures failed to meet the requirements 100%.

【Key words】Giardialamblia；Direct microscopy；Giemsa-fast staining；Multiplex polymerase chain reaction；Specific pathogen-free laboratory animal；Quality analysis

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)是一種呈全球性分布的寄生性腸道原蟲，引起以腹瀉、吸收障礙和消化不良為主的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis，簡(jiǎn)稱賈第蟲病)，也是HIV/AIDS合并感染機(jī)會(huì)原蟲。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲感染在旅游者中流行引起的腹瀉，也稱“旅游者腹瀉”。目前，賈第蟲病已被列為全世界危害人類健康的十種主要寄生蟲病之一[1-5]。

近年來，無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已廣泛應(yīng)用于食品藥品生物制品醫(yī)療器械的檢定和研究。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14922.1—2001)規(guī)定：鞭毛蟲(flagellates)是SPF實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猴均應(yīng)排除的寄生蟲項(xiàng)目之一，但國家標(biāo)準(zhǔn)中未列出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的檢測(cè)方法[6-7]。因此，快速準(zhǔn)確檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是一個(gè)重要問題。目前，尚未見不同方法檢測(cè)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的報(bào)道和有效數(shù)據(jù)。本研究建立了藍(lán)氏賈第鞭毛蟲直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)17個(gè)生產(chǎn)廠家516批2562只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論，希望對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)廠家及檢驗(yàn)單位有參考作用，從而共同提高SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，防止藍(lán)氏賈第鞭毛蟲污染。

1材料和方法

1.1儀器設(shè)備

生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)；LEICA DM2500生物顯微鏡(Leica Microsystems，德國)；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)(Nikon，日本)；二氧化碳培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystyem，美國)；凝膠成像分析系統(tǒng)(東樂自然基因生命科學(xué)公司)。

1.2樣品來源

本試驗(yàn)所用樣品來自17個(gè)生產(chǎn)廠家516個(gè)批次2562只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)于猴、犬活體采集新鮮糞便，對(duì)于兔、豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠則安樂死后采集腸樣本。

1.3直接鏡檢

取待測(cè)樣本，放入潔凈離心管中，加入生理鹽水，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，吸取中上層液體滴片，直接鏡檢，采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果。

1.4快速姬姆薩染色

取待測(cè)樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，吸取中上層液體滴片，用新鮮配制的姬姆薩快速染色，采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果。

1.5蟲體離體生存能力試驗(yàn)

取待測(cè)樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，1000 × g離心5 min，棄上清，沉淀重新以磷酸鹽緩沖液吹打懸浮，小心收集數(shù)條鮮活蟲體，放置于新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下放置，倒置顯微鏡下觀察蟲體存活狀態(tài)，實(shí)時(shí)拍攝記錄結(jié)果。

1.6 多重PCR

針對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲18S r DNA、β-giardin(β-賈第蟲素)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase，TPI)和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)基因設(shè)計(jì)四對(duì)引物。多重PCR引物名稱、序列和產(chǎn)物大小見表1。同上收集SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本中的數(shù)條鮮活蟲體，放置于潔凈離心管中，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作快速提取樣品基因組DNA。以抽提的DNA為模板，同時(shí)用剛地弓形蟲、結(jié)腸小袋纖毛蟲、四翼無翅線蟲DNA作為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴(kuò)增時(shí)的陰性對(duì)照。PCR總反應(yīng)體系為50 μ L，包括10 × Buffer (Mg2+Plus) 5.0 μ L、dNTP Mixture 4.0 μ L、正反向引物(1.0 μmol/μL)各0.5 μ L、EX Taq(5 U/μ L)0. 25 μ L、模板DNA 2.0 μL、nuclease-free water 37.75 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃ 5 min 1 循環(huán)；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 循環(huán)；72℃ 10 min 1 循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1　多重PCR引物

2結(jié)果

2.1直接鏡檢結(jié)果

吸取SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸樣本中鮮活蟲體，快速滴片，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄記載蟲體形態(tài)特征及運(yùn)動(dòng)方式：高倍鏡下觀察，可見數(shù)量眾多的鞭毛蟲滋養(yǎng)體(trophozoite)和包囊(cyst)。外觀略顯無色透明的鮮活的鞭毛蟲滋養(yǎng)體借助鞭毛擺動(dòng)快速翻滾運(yùn)動(dòng)，鞭毛蟲包囊移行速度較慢。鞭毛蟲滋養(yǎng)體呈縱切為半的倒置梨形，大小為(8～16)μm ×(5～12)μm，前端寬鈍，后端尖細(xì)，腹面扁平，背部隆起，兩側(cè)對(duì)稱，有前、后側(cè)、腹側(cè)和尾鞭毛共四對(duì)。鞭毛蟲包囊為橢圓形，大小為(8～12)μm ×(7～10)μm(彩插8圖1)。依據(jù)鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊大小形態(tài)特征及運(yùn)動(dòng)方式，鑒定為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲[8]。

2.2快速姬姆薩染色結(jié)果

用新鮮配制的姬姆薩液，對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸樣本中鮮活蟲體進(jìn)行快速染色，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄記載蟲體形態(tài)特征及運(yùn)動(dòng)方式：高倍鏡下觀察，可見大量藍(lán)色半透明鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊。滋養(yǎng)體呈典型的“笑臉樣”特征，一對(duì)細(xì)胞核位于蟲體前端1/2的吸盤部位。一對(duì)前鞭毛由此向前伸出體外，其余三對(duì)發(fā)出后在兩核間沿軸柱分別向體兩側(cè)、腹側(cè)和尾部伸出體外。未成熟包囊內(nèi)含2個(gè)細(xì)胞核，成熟包囊內(nèi)含4個(gè)細(xì)胞核(彩插8圖2)。依據(jù)鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊大小形態(tài)特征及運(yùn)動(dòng)方式，鑒定為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。

2.3蟲體離體生存能力試驗(yàn)結(jié)果

將從SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸樣本中收集到的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲鮮活蟲體，37℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下放置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在37℃藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體能夠存活一周。第4天時(shí)，蟲體四對(duì)鞭毛齊全，結(jié)構(gòu)完整，運(yùn)動(dòng)自如(彩插8圖3)。第8 天后，蟲體部分鞭毛脫落，結(jié)構(gòu)松散，無自主運(yùn)動(dòng)能力，出現(xiàn)死亡(封3圖4)。

2.4多重PCR結(jié)果

在上述收集到的SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)條鮮活蟲體樣品中均檢出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI 和GDH 基因特異性DNA片段(大小分別為190 bp、231 bp、290 bp和356 bp)，而作為陰性對(duì)照的剛地弓形蟲、結(jié)腸小袋纖毛蟲、四翼無翅線蟲樣本卻未觀察到目的基因片段擴(kuò)增。SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(封3圖5)。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴(kuò)增獲得了清晰特異的18S rDNA、β-giardin、TPI 和GDH基因目的條帶，分子鑒定結(jié)果證明SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然感染的確實(shí)是藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。

結(jié)果顯示，直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法均能檢出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。在SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢出數(shù)量眾多的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊，鑒定出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因。17個(gè)生產(chǎn)廠家516批2562只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲陽性檢出率22.9%(586/2562)。

3討論

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲同種異名腸賈第蟲(Giardiaintestinalis)或十二指腸賈第蟲(Giardiaduodinalis)，簡(jiǎn)稱賈第蟲，隸屬于雙滴蟲目(Diplomonadida)，六鞭毛科(Hexamitidae)，賈第鞭毛蟲屬(Giardia)。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體最先由荷蘭學(xué)者Antonivan Leeuwenhoek(1632-1723)于1681年在自己腹瀉的糞便內(nèi)發(fā)現(xiàn)。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊由Grassi于1879年發(fā)現(xiàn)。1888年Blanchard[9]將該蟲命名為L(zhǎng)amblia intestinalis。1915年Kofoid[10]提出改為Giardialamblia。

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是典型的真核生物，厭氧，缺乏線粒體氧化磷酸化的或任何組件。本文作者在37℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下研究發(fā)現(xiàn)，SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鮮活藍(lán)氏賈第鞭毛蟲蟲體離體能存活一周。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲生活史簡(jiǎn)單，包括滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段。滋養(yǎng)體為營養(yǎng)繁殖階段，包囊為傳播階段。滋養(yǎng)體主要寄生于十二指腸、小腸、大腸，蟲體借助吸盤吸附于腸絨毛表面，以二分裂方式進(jìn)行繁殖，在腸道內(nèi)環(huán)境不利情況下，分泌囊壁形成包囊并隨糞便排出體外。Bingham等[11]人研究了物理因素參與的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲脫囊和生存能力，在實(shí)驗(yàn)室條件下包囊8℃存活77 d，21℃存活5～24 d，37℃存活不超過4 d。包囊在水中和涼爽環(huán)境中可存活數(shù)天甚至數(shù)月之久。人和動(dòng)物攝入被包囊污染的飲水或食物而被感染。成熟的4核包囊被宿主吞食后，在十二指腸內(nèi)脫囊形成2個(gè)滋養(yǎng)體。Rendtorff[12]研究發(fā)現(xiàn)人類被藍(lán)氏賈第鞭毛蟲感染的劑量?jī)H為10個(gè)包囊。

18S rDNA為rDNA基因中進(jìn)化相對(duì)保守的部分，含有大量物種間進(jìn)化的信息。β-giardin是藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的一種結(jié)構(gòu)蛋白，為滋養(yǎng)體腹吸盤的一部分，TPI、GDH基因?qū)儆诨蚪M中進(jìn)化較快的部分。本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)獲得了SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因的片段，多位點(diǎn)測(cè)序和基因分型工作正在進(jìn)行，為進(jìn)一步開展藍(lán)氏賈第鞭毛蟲遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然感染的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲進(jìn)行了病原學(xué)和分子診斷。在SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本中發(fā)現(xiàn)了藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的滋養(yǎng)體和包囊，蟲體鮮活數(shù)量眾多。應(yīng)用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄技術(shù)跟蹤監(jiān)測(cè)寄生蟲，獲得了藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊典型特征形態(tài)及獨(dú)特運(yùn)動(dòng)方式的寶貴視頻資料。應(yīng)用多重PCR技術(shù)，從分子水平上對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然感染的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲進(jìn)行多基因特征確認(rèn)，為快速準(zhǔn)確鑒別診斷藍(lán)氏賈第鞭毛蟲感染提供了有效方法。

綜上所述，直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法具有高度的敏感性和特異性，可用于藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的快速診斷。17個(gè)生產(chǎn)廠家516批SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲檢查結(jié)果未能全部符合規(guī)定。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲作為一種重要的人獸共患寄生蟲病賈第蟲病的病原，其對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量造成的潛在威脅不容忽視。SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已廣泛應(yīng)用于食品藥品生物制品醫(yī)療器械的檢定和研究，人獸共患寄生蟲感染會(huì)造成嚴(yán)重不良后果。

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〔修回日期〕2014-12-08