獲能培養(yǎng)液等因素對遺傳工程小鼠凍融精子體外受精率的影響

研究報告

獲能培養(yǎng)液等因素對遺傳工程小鼠凍融精子體外受精率的影響

左琴1，范濤1，張翠平2，楊文東2，王勁松1，范昌發(fā)1，劉佐民1，賀爭鳴1，李保文1

(1. 中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實驗動物種子中心，北京100050；

2. 北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，北京100076)

【摘要】目的探討遺傳工程小鼠精子冷凍、復(fù)蘇及體外受精率的效果，建立簡便、經(jīng)濟(jì)的遺傳工程小鼠保種體系。方法采用精子冷凍、體外受精和胚胎移植技術(shù)，比較了精子獲能培養(yǎng)液、雄鼠周齡及精子凍存液等因素對于遺傳工程小鼠精子冷凍保存的影響。結(jié)果用CPA精子凍存液冷凍保存精子，精子復(fù)蘇后用PM精子培養(yǎng)液獲能培養(yǎng)，體外受精率在82.49%～91.43%，而HTF精子培養(yǎng)液的體外受精率為14.46%～27.38%，同品系間差異極顯著(P<0.01)；10～35周齡的雄鼠精子均能成功冷凍、受精，移植后產(chǎn)仔；使用R18S3，CPM，CPA三種不同精子凍存液冷凍遺傳工程小鼠精子，復(fù)蘇后采用PM精子培養(yǎng)液體外受精，受精率分別是75.85%、88.89%和94.27%，移植后得到陽性小鼠；體外受精后的胚胎成功冷凍保存，移植后產(chǎn)仔。結(jié)論采用CPA精子凍存液冷凍保存精子，精子復(fù)蘇后用PM精子培養(yǎng)液體外受精，能夠更有效地保存遺傳工程小鼠。

【關(guān)鍵詞】精子；冷凍保存；體外受精；胚胎移植；遺傳工程小鼠

[基金項目]國家科技支撐計劃(2013BAK11B00)。

[作者簡介]左琴(1975-)，女，副研究員，碩士，研究方向：實驗動物遺傳與保種。

[通訊作者]李保文(1967-)，男，副主任技師，研究方向：實驗動物管理與GLP，E-mail: libaowen2003@aliyun.com；賀爭鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：微生物學(xué)和免疫學(xué)，E-mail: zhengminghe57@163.com。

【中圖分類號】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.008

Effects of preincubation medium and other factors affecting

invitrofertilization rate of post-thawed genetically

engineering mouse spermatozoa

ZUO Qin1，F(xiàn)AN Tao1，ZHANG Cui-ping2，YANG Wen-dong2，WANG Jin-song1，F(xiàn)AN Chang-fa1，

LIU Zuo-min1，HE Zheng-ming1，LI Bao-wen1

(1. Laboratory Animal Resource Center, National Institutes Food and Drug Control, Beijing 100050, China;

2.Beijing Biocytogen Co., Ltd, Beijing 100076, China)

Abstract【】ObjectiveTo discuss the effect of in vitro fertilization (IVF) and mouse sperm cryopreservation, to establish a simple and economic frozen system for the genetically engineering mice preservation. Methods Sperm from genetically engineering mice were cryopreserved, IVF was performed using post-thawed sperm, then embryo transfer,to compare the effects of cryopreservation medium、age of male mice and sperm preincubation medium. ResultsUsing CPA as sperm cryopreservation medium, when PM was used thawed-sperm preincubation in IVF, the fertility rates were from 82.49% to 91.43%, when HTF was used thawed-sperm preincubation in IVF, the fertility rates were from14.46% to 27.38%, there was a signification difference between PM and HTF sperm preincubation medium; 10 to 35 weeks male genetically engineering mice sperm were succeed cryopreservation, and positive mice were procreated after 2-cell embryos were transferred; R18S3、CPM and CPA was used to freeze sperm, the fertility rates were 75.85%、88.89% to 94.27%, positive mice were procreated after 2-cell embryos were transferred; 2-cell embryos after IVF were freezed, then thawed and positive mice were procreated after 2-cell embryos were transferred. Conclusion Using CPA as sperm cryopreservation medium, when PM was used thawed-sperm preincubation in IVF, genetically engineering mice sperm were succeed cryopreservation.

【Key words】Sperm；Cryopreservation；In vitro fertilization；Embryo transfer；Genetically engineering mice

CRISPR-Cas技術(shù)的發(fā)展，有效補充了鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN)、胚胎干細(xì)胞打靶和TALEN等制作動物模型方法，將會更有效、更快地研發(fā)出遺傳工程小鼠[1]。隨著這些基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，遺傳工程小鼠越來越多的應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，已滲透到醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、動物育種學(xué)等各個領(lǐng)域。得到的遺傳工程小鼠模型在繁殖建系過程中，由于遺傳漂變和空間、人力、物力等問題，對其配子細(xì)胞進(jìn)行有效的冷凍保存有實際應(yīng)用價值，而且也便于運輸和進(jìn)行國際間的交流[2-3]。因此，對保存大量的遺傳工程小鼠而言，精子冷凍保存是一種簡單而有效的方式[4]。精子冷凍保存和體外受精技術(shù)結(jié)合可以用于大多數(shù)品系產(chǎn)生大量的胚胎，進(jìn)行繁殖生產(chǎn)和種系的擴(kuò)群。

C57BL/6近交系小鼠是最常用于遺傳工程小鼠制作的背景小鼠，但其精子在復(fù)蘇后的成活率和體外受精率較低，成為冷凍保種的一個瓶頸，Nakagata等改進(jìn)了C57BL/6小鼠凍精復(fù)蘇后的獲能培養(yǎng)，提高了IVF生產(chǎn)遺傳工程小鼠的效率[5]。

本實驗按照Nakagata改進(jìn)的試劑和方法對不同遺傳工程小鼠的精子凍存和體外受精進(jìn)行了初步研究和探討。

1材料和方法

1.1儀器和試劑

CO2培養(yǎng)箱(Thermo 8000DH，美國)、體視顯微鏡(Nikon SMZ624，日本)、液氮罐(Taylor-Wharton HC-35，美國)、麥管封口機(jī)(Cryologic HAS-1，美國)；孕馬血清(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(均購于寧波第二激素廠，中國)、KSOM培養(yǎng)液(Millipore MR-106-D，美國)、CPM精子凍存液(JASKON LABORATORY，美國)、R18S3精子凍存液、CPA精子凍存液、HTF培養(yǎng)液和PM精子培養(yǎng)液、CARD MEDIUM培養(yǎng)液(日本熊本大學(xué)動物資源研發(fā)中心贈送)。PCR檢測所用試劑(購于寶生物工程(TaKaRa)大連有限公司，中國)，引物由北京諾賽基因研究公司合成。

1.2實驗動物

遺傳工程小鼠(均以C57BL/6J近交系小鼠為背景)來自本單位和北京百奧賽圖公司研發(fā)制作，KM、C57BL/6J小鼠由本單位自供，飼養(yǎng)于國家嚙齒類實驗動物種子中心【SCXK(京)2009-0017】，繁育和實驗環(huán)境均為屏障系統(tǒng)。本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進(jìn)行。

1.3精子冷凍和復(fù)蘇

按照Nakagata方法冷凍精子和復(fù)蘇[5]。頸椎脫臼處死雄鼠，取出附睪尾，在體式顯微鏡下除凈附睪尾上的脂肪和血液后，將附睪尾放入120 μLCPM、R18S3或CPA精子凍存液液滴的培養(yǎng)皿中，用維納斯剪剪開附睪尾，將培養(yǎng)皿放到37℃恒溫板上平衡3 min，且每隔1 min輕輕晃動培養(yǎng)皿，以便精子從改為從附睪尾游出。取精子懸浮液在培養(yǎng)皿上做10個液滴，每滴10 μL，用0.25 mL麥管先裝入0.1 mL HTF溶液，間隔1.5 cm的空氣段，裝入10 μL精子懸浮液，最后將麥管兩端都熱封口，連續(xù)裝好10根麥管后，將所有麥管放在液氮蒸汽上預(yù)冷10 min后沉入液氮中，1～2月后解凍復(fù)蘇。

在復(fù)蘇前，將麥管從液氮中取出，在37℃水浴鍋中平衡10 min，將10 μL精子懸浮液加入90 μL HTF或PM培養(yǎng)液中，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。

1.4體外受精

IVF操作按文獻(xiàn)描述[5]，對4周齡C57BL/6J雌鼠間隔48 h腹腔注射PMSG和hCG進(jìn)行超數(shù)排卵。在hCG注射14～15 h后，一次頸椎脫臼處死3只雌鼠，快速取出輸卵管，放到已經(jīng)覆蓋石蠟油的HTF或CARD MEDIUM受精滴。在顯微鏡下用眼科鑷和解剖針將卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COCs)從膨大部釋放。將COCs引入90 μL HTF液滴中。將10 μL新鮮或復(fù)蘇的精子懸浮液加入覆蓋有石蠟油的有COCs的受精液滴，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)5～6 h后，用HTF液滴(100 μL)將受精卵清洗3次。此時，用相差顯微鏡可以觀察到原核的形成。在受精24 h后，挑選出發(fā)育正常的2-細(xì)胞期胚胎，放入CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待凍存或胚胎移植。體外受精率的計算是用2細(xì)胞胚胎數(shù)量除以總的受精卵數(shù)量乘以100。

1.5胚胎冷凍和復(fù)蘇

采用簡易玻璃化冷凍-解凍法凍存胚胎和復(fù)蘇胚胎[6]。將待凍存的2-細(xì)胞胚胎置于1mol/L DMSO液滴中靜置數(shù)分鐘，用微量移液器吸取5 μL含有胚胎的DMSO于冷凍管中，在0℃恒溫器中平衡5 min，再加入45 μL DAP213溶液，0℃下再次平衡5 min，放到液氮中保存。

復(fù)蘇方法是，將凍存管從液氮中取出，室溫下靜置約30 s，加入0.9 mL 37℃預(yù)熱的0.25 mol/L蔗糖溶液，將有胚胎的溶液移入35 mm培養(yǎng)皿，在顯微鏡下回收復(fù)蘇胚胎，觀察記錄結(jié)果；將狀態(tài)良好的2-細(xì)胞胚移入KSOM培養(yǎng)液，放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待移植。

1.6胚胎移植和后代檢測

采用輸卵管內(nèi)移植法[7]，結(jié)扎KM雄鼠與正常KM雌鼠以1:1合籠，翌日檢查陰栓，見栓者為假孕0.5 d，2細(xì)胞胚胎移植至假孕0.5 d雌鼠的輸卵管內(nèi)，兩側(cè)輸卵管各移植10～15個胚胎，出生后統(tǒng)計其產(chǎn)仔率。在仔鼠離乳前剪尾進(jìn)行PCR檢測。

1.7數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗進(jìn)行結(jié)果分析。

2結(jié)果

2.1精子復(fù)蘇后獲能培養(yǎng)液的影響

選取12周齡A、B、C、D四種遺傳工程雄鼠和C57BL/6J近交系雄鼠，用CPA為精子凍存液進(jìn)行精子冷凍，冷凍精子復(fù)蘇后采用HTF或PM培養(yǎng)液培養(yǎng)獲能，加入有卵母細(xì)胞的受精液滴進(jìn)行體外受精，翌日統(tǒng)計2細(xì)胞胚胎數(shù)量(表1)。四種遺傳工程小鼠和C57BL/6J小鼠的凍精復(fù)蘇后，用HTF培養(yǎng)獲能，其體外受精率分別是25.32%、14.46%、26.32%、18.48%和27.38%，而使用PM培養(yǎng)獲能體外受精率分別是91.43%、84.56%、88.89%、89.95%和82.49%(P<0.01)。使用HTF培養(yǎng)獲能明顯低于用PM培養(yǎng)獲能。

2.2雄鼠周齡對精子凍存的影響

選取10、15、20、25、30、35周齡同種純合遺傳工程雄鼠，用CPA冷凍保存精子，用PM進(jìn)行復(fù)蘇精子的培養(yǎng)，進(jìn)行體外受精和2細(xì)胞胚胎移植。從表2可見，10～35周齡的雄鼠精子凍存，復(fù)蘇后20周齡雄鼠精子體外受精率最高，是92.75%，35周齡雄鼠精子體外受精率最低，是59.30%，胚胎移植后產(chǎn)仔。

2.3精子凍存液對復(fù)蘇影響結(jié)果

選取12周齡同種雜合遺傳工程雄鼠，分別用R18S3、CPM和CPA精子凍存液進(jìn)行精子凍存，解凍復(fù)蘇后和C57BL/6J雌鼠體外受精并移植。CPA精子凍存液的效果最好，精子復(fù)蘇后體外受精率達(dá)94.27%，R18S3凍存液凍存的精子復(fù)蘇后體外受精率是75.85%(表3)。

2.4遺傳工程小鼠體外受精后胚胎冷凍保存

對5種遺傳工程小鼠冷凍精子復(fù)蘇進(jìn)行體外受精，獲得的2細(xì)胞胚胎進(jìn)行冷凍保存，復(fù)蘇后胚胎移植，檢測其冷凍效果。胚胎的復(fù)蘇率在66.00%～89.33%間，胚胎移植后產(chǎn)仔，在檢測后得到陽性小鼠(表4)。

表1　精子解凍復(fù)蘇后獲能液對受精率的影響

注：**表示差異極顯著性，*表示差異顯著性。

Note :**very significant difference ,*significant difference.

表2　雄鼠周齡對精子凍存復(fù)蘇的影響

表3　精子凍存液對精子冷凍復(fù)蘇的影響

表4　遺傳工程小鼠胚胎冷凍復(fù)蘇移植結(jié)果

3討論

對于科研工作中研發(fā)的大量遺傳工程小鼠，較為珍貴，有進(jìn)行種子資源保存的必要性，確立簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的保種方法有較高的實用性。本次試驗通過體外受精效果的比較，以CPA為精子凍存液，凍存精子復(fù)蘇后采用PM培養(yǎng)液培養(yǎng)后進(jìn)行體外受精，對于以C57BL/6為背景的遺傳工程小鼠有較好的保存效果。

3.1冷凍精子復(fù)蘇培養(yǎng)液和體外受精液的改進(jìn)

C57BL/6近交系小鼠作為最常用于遺傳工程小鼠制作的背景小鼠，其精子在凍存復(fù)蘇后的受精率非常低[8-9]。Takeo等[5]改進(jìn)了精子冷凍保存和體外受精技術(shù)，在冷凍精子復(fù)蘇后的獲能培養(yǎng)中，添加MBCD配制成精子獲能培養(yǎng)液PM顯著增加了體外受精率。MBCD可以形成親脂性物質(zhì)，促進(jìn)精子細(xì)胞膜膽固醇的釋放，誘導(dǎo)了精子獲能，增加了精子受精力[10]，同時提出在體外受精液中添加還原型GSH將增加體外受精率，還原型GSH增加了胚胎透明帶的自由硫醇并刺激透明帶放大[10]。本實驗中用HTF和PM分別進(jìn)行冷凍精子復(fù)蘇后培養(yǎng)，結(jié)果表明PM培養(yǎng)液的使用極大提高的以C57BL/6小鼠為背景的遺傳工程小鼠冷凍精子的體外受精率。

3.2適合凍存的雄鼠周齡范圍

遺傳工程小鼠在制作完成后，由于種群數(shù)量極少，在短期內(nèi)不易擴(kuò)繁其種群，為了避免遺傳漂變、飼養(yǎng)空間限制等的影響，需要盡快進(jìn)行保存，精子冷凍保存是較為有效的保存方式之一。精子冷凍保存對所保種的雄鼠周齡是有要求的，在進(jìn)行精子冷凍和體外受精時，都要求雄鼠要達(dá)到性成熟和體成熟，本實驗對小鼠的周齡范圍做了實驗，在活體保種中通常使用10周齡以上的小鼠進(jìn)行繁殖基礎(chǔ)上，選擇了10～35周齡雄鼠，從實驗結(jié)果來看那，10～35周齡的雄鼠精子都可以成功冷凍保存并且在復(fù)蘇后產(chǎn)仔。多數(shù)文獻(xiàn)報道精子冷凍的周齡在12～20周齡[8]，但品系間有差異，陸曄等報道了10～20周齡的KM小鼠精子成功冷凍并在復(fù)蘇后產(chǎn)仔[11]。

3.3精子凍存液的選擇

目前，小鼠使用的精子凍存液均是以棉籽糖和脫脂奶按比例混合為基礎(chǔ)液配制，對市面上可以購買到的R18S3、CPM和CPA三種凍存液比較，表明CPA的效果最好，但是CPM和CPA的價錢較為昂貴，R18S3也可以達(dá)到保種的目的。

3.4胚胎冷凍

小鼠的胚胎冷凍是較為成熟的保種方式，相對于精子冷凍而言，胚胎冷凍需要大量的動物，在遺傳工程小鼠種群較小的前提下，精子冷凍更為實用。但精子冷凍在復(fù)蘇后需要進(jìn)行體外受精的準(zhǔn)備，而胚胎冷凍可以復(fù)蘇后直接進(jìn)行胚胎移植，兩種方式各有其優(yōu)缺點，對于保種單位兩種冷凍保種方式是相互補充的。

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〔修回日期〕2014-12-03