響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取河陰石榴多糖工藝研究

閆生輝+李興奎+高玉紅

摘要：為了優(yōu)化河陰石榴（Punica granatum L.）多糖的超聲波提取工藝，研究了超聲波提取時(shí)的提取溫度、液料比、超聲功率和超聲時(shí)間單因素條件對(duì)河陰石榴多糖提取效果的影響，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法建立二次回歸模型，同時(shí)對(duì)各因素和因素交互作用進(jìn)行方差分析，從而確定河陰石榴多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取溫度48.5 ℃，提取時(shí)間36 min，超聲波功率390 W。在此條件下，石榴多糖提取率的預(yù)期值為15.95%，試驗(yàn)驗(yàn)證值為15.68%。將優(yōu)化后的試驗(yàn)條件與傳統(tǒng)的水提法相比，不但提高了石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79個(gè)百分點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：河陰石榴（Punica granatum L.）;多糖;超聲波提取;響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：S665.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? 文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5987-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.049

Optimization of Polysaccharides from Heyin Pomegranate Using Response Surface Methodology and Ultrasonic Extraction

YAN Sheng-hui，LI Xing-kui，GAO Yu-hong

（Zhengzhou Vocational Technology College， Zhengzhou 450121， China）

Abstract： In order to optimize ultrasonic extraction of polysaccharides in Heyin Pomegranate（Punica granatum L.），effects of extraction temperature，ratio of water to material，extraction rate and extraction time were investigated respectively in single-factor tests. Based on the principle of Box-Behnken design， response surface methodology with three factors and three levels were applied，and then interactive effects of the independent variables on extraction were established. The result showed that the optimum extraction temperature，time，and rate for polysaccharides extraction from Heyin Pomegranate are 48.5 ℃，36 min，390 W，respectively. Under the above conditions，the actual extraction rate reached up to 15.68%， which was close to the predicted value of 15.95%.Compared with the traditional water extraction method，the efficiency of optimization of polysaccharides from Heyin Pomegranate was greatly improved，and the extraction yield of polysaccharide was increased by 5.79 percentage points.

Key words： Heyin Pomegranate（Punica granatum L.）; polysaccharides; ultrasonic extraction; response surface methodology

石榴（Punica granatum L.）是落葉喬木或灌木，屬于石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）植物，原產(chǎn)巴爾干半島至伊朗及其鄰近地區(qū)，現(xiàn)主要分布在亞洲、非洲、歐洲沿地中海等溫帶和熱帶地區(qū)[1]。石榴在中國(guó)南北各地均有種植，主要分布在陜西、安徽、山東、江蘇、河南、四川、云南及新疆等地。目前，有瑪瑙石榴、粉皮石榴、青皮石榴、玉石子等70多個(gè)種類，其中河南省滎陽市的河陰石榴因其果實(shí)色澤鮮艷，石榴皮薄光滑，特別是石榴仁特軟可食，其味甘甜而無渣滓，結(jié)束了吃石榴吐子的歷史，因此河陰石榴暢銷全國(guó)，為河南特產(chǎn)之一。近年來，各國(guó)科研工作者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)石榴中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、類固醇、激素、生物堿和多糖等活性物質(zhì)[2-5]，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健領(lǐng)域。

多糖廣泛分布于自然界的多種生物體中，尤其是動(dòng)物細(xì)胞膜、植物細(xì)胞壁和微生物細(xì)胞壁中，是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是構(gòu)成生命體的分子基礎(chǔ)之一。多糖具有多種藥理活性，它不僅可以作為廣譜免疫促進(jìn)劑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，還在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗輻射等方面發(fā)揮廣泛的藥理作用。迄今為止，已有300多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中分離出來，其中從植物中提取的水溶性多糖最為重要。因?yàn)槠渌幚砘钚詮?qiáng)，來源廣泛，細(xì)胞毒性低，安全性強(qiáng)，毒副作用較小，已引起醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[6-10]。endprint

超聲波輔助提取法是一種從植物中提取有效成分的重要方法，依靠的是超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用[11-14]，近年來被廣泛用于植物有效成分的提取研究。目前，關(guān)于河陰石榴超聲波多糖提取的工藝鮮有研究報(bào)道，本試驗(yàn)將超聲波技術(shù)應(yīng)用于河陰石榴的多糖提取工藝，并運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，從而得到最佳的提取工藝條件，為河陰石榴多糖的制備提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

滎陽市廣武鄉(xiāng)陣溝河陰石榴生產(chǎn)基地采集新鮮石榴，選取樣品以色澤鮮艷、外表光滑、大小適中為標(biāo)準(zhǔn)，室內(nèi)常溫貯藏15 d。葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚等試劑均為分析純。

主要儀器和設(shè)備：組織搗碎機(jī)（DFT-250型），上海麥尚科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱（WHL-25A型），河南省泰斯特儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800型），日本島津公司;超聲波提取機(jī)（KB-50型），北京林子大科技有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)（80-2型），上海醫(yī)療機(jī)械有限公司;電子天平（WA），上海方瑞儀器有限公司。

1.2 ?河陰石榴中多糖的測(cè)定

河陰石榴中多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[15]。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以去離子水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min以后于490 nm測(cè)定吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，以多糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取樣品1 g加1 mL 15%三氯乙酸溶液進(jìn)行反復(fù)研磨，將清液和殘?jiān)黄鸬饺?0 mL的離心管中進(jìn)行離心。取上清液到25 mL錐形比色管中，加入2 mL 6 mol/L鹽酸之后搖勻，最后濾液保持18 mL左右，在96 ℃水浴鍋中水浴2 h。冷卻后加入2 mL 6 mol/L 氫氧化鈉定容至25 mL的容量瓶中。吸取0.2 mL的樣品溶液，以去離子水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻至室溫時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到多糖濃度后計(jì)算多糖提取率：

多糖提取率=多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.3 ?單因素試驗(yàn)

1）提取溫度對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預(yù)處理好的樣品5份，加入40 mL的去離子水后分別置于30、40、50、60、70 ℃的水浴中進(jìn)行充分的溶解。在400 W的超聲波功率下提取35 min，測(cè)定不同提取溫度下河陰石榴多糖的提取率。

2）提取時(shí)間對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預(yù)處理好的樣品5份，分別加入40 mL的去離子水后置于50 ℃的水浴中進(jìn)行充分溶解。在400 W的超聲波功率下分別提取25、30、35、40、45 min，測(cè)定不同提取時(shí)間下河陰石榴多糖的提取率。

3）超聲波功率對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預(yù)處理好的樣品5份，加入40 mL的去離子水后置于50 ℃的水浴中進(jìn)行充分的溶解。分別在200、300、400、500、600 W的超聲波功率下提取35 min，測(cè)定不同超聲波功率下河陰石榴多糖的提取率。

4）液料比對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預(yù)處理好的樣品5份，分別加入20、30、40、50、60 mL的去離子水后分別置于50 ℃的水浴中進(jìn)行充分溶解。在400 W的超聲波功率下提取35 min，測(cè)定不同液料比下河陰石榴多糖的提取率。

1.4 ?響應(yīng)面試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)研究了提取時(shí)溫度、液料比、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)提取河陰石榴多糖的影響，從而確定提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和超聲波功率（X3）作為主要自變量，采用響應(yīng)面法對(duì)河陰石榴多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用Box-Behnken Design（BBD）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過擬合二次多項(xiàng)式方程，計(jì)算出最優(yōu)工藝組合以及在此條件下河陰石榴多糖提取率的最大理論值[16-20]。以+1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，以河陰石榴多糖提取率為目標(biāo)，通過響應(yīng)曲面分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)曲面因素和水平如表1所示。

1.5 ?驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

按照計(jì)算分析得到的最佳工藝條件進(jìn)行提取試驗(yàn)操作，從而驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。并將試驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)的水提法提取多糖的提取率進(jìn)行結(jié)果比較[21]，證明優(yōu)化后超聲波提取工藝的優(yōu)越性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?提取溫度對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖1可知，在一定的條件下隨著提取溫度的升高，河陰石榴多糖的提取率逐漸增大，在50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，溫度繼續(xù)升高，對(duì)提取率影響不大?？赡苁窃诖藯l件下多糖分子已經(jīng)具有了從樣品中脫離的動(dòng)能，繼續(xù)升高溫度對(duì)提取率沒有明顯的影響。因此，最佳的提取溫度確定為50 ℃。

2.1.2 ?提取時(shí)間對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖2可知，在一定的條件下，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，河陰石榴多糖提取率逐漸上升，35 min時(shí)達(dá)到了峰值，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，提取率反而減小。可能是延長(zhǎng)時(shí)間有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放，然而過長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致了多糖在酸性條件下發(fā)生了水解，從而降低了提取效率。因此，最佳的超聲提取時(shí)間確定為35 min。

2.1.3 ?超聲波功率對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖3可知，隨著超聲波功率的增大，河陰石榴多糖提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在功率為400 W時(shí)提取率最高，可能是當(dāng)超聲波的功率為400 W左右時(shí)，多糖分子具有的動(dòng)能能夠使其最大限度地從樣品中釋放出來。然而隨著超聲波功率的繼續(xù)增大，可能使多糖分子具有了更大的能量，反而促使了多糖分子的降解，從而導(dǎo)致了提取率的降低。因此，最佳提取率確定為400 W。endprint

2.1.4 ?液料比對(duì)河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖4可知，在一定的條件下，隨著液料比的增大，多糖提取率逐漸上升，當(dāng)液料比大于20∶1時(shí)對(duì)多糖提取率幾乎沒有影響，因此在進(jìn)一步條件優(yōu)化時(shí)，選擇液料比為20∶1的固定值。

2.2 ?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 ?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 ?根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合RSM的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，取2.000 g預(yù)處理好的樣品17份，擇優(yōu)選取提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和超聲波功率（X3）3個(gè)對(duì)多糖提取率相對(duì)重要的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法分析優(yōu)化工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。

從響應(yīng)面方差分析表3可知，由試驗(yàn)結(jié)果得到的模型F為17.34，P為0.000 5，表明該模型顯著。由模型擬合得到的回歸方程為R1=15.69-0.27X1+0.28X2+0.93X3-（7.5E-3）X1X2+0.13X1X2-0.28X2X3-0.28X12-0.80X22-X32，其方程的R2為0.957 1。方程中P值小于0.05的項(xiàng)代表顯著項(xiàng)，包括X1提取溫度，X2提取時(shí)間，X3超聲波功率及其二次項(xiàng)X22、X32。由擬合得到的回歸方程可知，各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，方程的失擬度值為0.43，表示該回歸方程相對(duì)于絕對(duì)誤差而言失擬度并不顯著，能夠較準(zhǔn)確地反映各影響因素與其響應(yīng)值之間的關(guān)系，多糖的最佳提取工藝條件可以由此方程確定，得到最優(yōu)提取工藝為河陰石榴多糖提取率最大預(yù)測(cè)值15.95%相對(duì)應(yīng)的提取工藝條件為：提取溫度48.5 ℃，提取時(shí)間36.2 min，超聲波功率396.5 W。

2.2.2 ?試驗(yàn)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的3D分析 ?提取時(shí)間和提取溫度交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的3D分析如圖5所示。由圖5可知，提取時(shí)間和提取溫度對(duì)河陰石榴多糖的提取率影響不大。當(dāng)溫度過高時(shí)多糖的提取率減少，可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致多糖的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而影響了多糖的提取率。

提取時(shí)超聲波功率和提取溫度交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的3D分析如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)超聲波功率和提取溫度過高時(shí)，導(dǎo)致多糖提取率明顯下降，可能是因?yàn)樵诟邷貢r(shí)，過高的超聲波功率更容易破壞多糖分子的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致多糖提取率的下降。

提取時(shí)超聲波功率和提取時(shí)間交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的3D分析如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)超聲波功率和提取時(shí)間超過一定值時(shí)，在過長(zhǎng)的時(shí)間里高強(qiáng)度的超聲功率嚴(yán)重破環(huán)了多糖的組織結(jié)構(gòu)，從而降低了多糖的提取率。

由以上分析可知，超聲波功率和提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響較大，其交互項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響也較大，而提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小，這和響應(yīng)曲面的方差分析結(jié)果一致，這表明由各個(gè)試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的關(guān)系模擬與試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)較為吻合，因此可以用此模型得到多糖的最佳提取工藝條件。

2.3 ?最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證

根據(jù)以上分析并結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作條件，將河陰石榴多糖提取工藝條件修正為提取溫度48.5 ℃，提取時(shí)間36 min，超聲波功率390 W。河陰石榴多糖提取率為15.68%，接近預(yù)測(cè)值15.95%，結(jié)果較為理想。試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的水提法得到河陰石榴的多糖提取率為9.89%，相比于傳統(tǒng)的提取方法使多糖提取率提高了5.79個(gè)百分點(diǎn)。

3 ?小結(jié)

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助提取河陰石榴多糖的工藝，得到的最佳提取工藝條件為提取溫度48.5 ℃，提取時(shí)間36 min，超聲波功率390 W。在此條件下，河陰石榴多糖提取率的預(yù)期值為15.95%，試驗(yàn)驗(yàn)證值為15.68%。將優(yōu)化后的試驗(yàn)條件與傳統(tǒng)的水提法相比，不但提高了河陰石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79個(gè)百分點(diǎn)。

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