微生物源殺菌劑先導化合物篩選研究

張志剛+楊自文+王開梅+張遵霞

摘要：以番茄早疫病菌（Alternaria solani）作為產(chǎn)孢病原菌的代表，進行了孢子濃度和培養(yǎng)時間對其敏感性影響的篩選試驗;以小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）作為不產(chǎn)孢病原菌的代表，進行了菌絲碎片計數(shù)，同時比較了接菌濃度和培養(yǎng)時間對其敏感性影響的篩選試驗;用兩個殺菌劑標準樣品進行了篩選穩(wěn)定性比較試驗，同時對576個微生物源提取物進行了篩選試驗。結果表明，殺菌劑篩選必須控制接菌濃度和培養(yǎng)時間，從而保持適當?shù)幕钚悦舾卸龋拍艿玫椒€(wěn)定的篩選結果。適當降低接菌濃度和縮短培養(yǎng)時間可以提高活性樣品的敏感度，有效的減少低活性樣品的漏篩。

關鍵詞：番茄早疫病菌（Alternaria solani）;小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）;先導化合物;殺菌活性;微生物源提取物

中圖分類號：S482.4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5896-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.024

Studies on Screening of Lead Compounds of Fungicide from Microorganism

ZHANG Zhi-gang，YANG Zi-wen，WANG Kai-mei，ZHANG Zun-xia

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesiticide， Hubei Agricultural Scientific and

Technological Innovation Center）

Abstract：One was Alternaria solani， which could produce a large number of spores in PDA medium. The other one was Septoria nodorum Berk， which couldn't produce spores in PDA medium. The sensitivity of screening results had been studied with different concentration of spores and infection time of A. solani. Homogenized the mycelia of S. nodorum Berk， and counted the number of mycelia fragments after filtration with Nylon net， and the sensitivity of screening had been studied with different concentration of mycelia fragments and infection time too. The two pathogenic fungus had been tested for their responses to 2 commercial fungicide standards， and had screened with 576 microbial extracts. The results showed that the stable screening results based on the appropriate sensitivity. The sensitivity affected by the appropriate inoculation concentration and incubation time of infection. Reduce the inoculation concentration and incubation time could improve sensitivity of screening， also could ensure that low active compounds would not be missed.

Key words：Alternaria solani;Septoria nodorum Berk;lead compound; fungicidal activity;microbial extract

為了提高篩選效率，殺菌劑先導化合物篩選不僅要有多個具有代表性的靶標，同時還要有高度敏感性，這與常規(guī)殺菌活性測定有很大差別。由于先導化合物在原材料中含量低、活性低，其對常規(guī)殺菌劑靶標無明顯活性甚至不顯示活性，因此先導化合物的篩選必須盡可能提高篩選靶標的敏感度，以增大具有潛在農藥活性的先導化合物的發(fā)現(xiàn)機率。半固體法因其便于使用微孔板進行高通量篩選，常作為先導化合物篩選的首選方法。部分農業(yè)病原真菌在培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢量少，因而只能用菌絲進行篩選，而菌絲的接種量難以定量，往往導致篩選結果不穩(wěn)定。隨著培養(yǎng)時間的增加，活性樣品被加速消耗，同時真菌量還在加速增長。針對以上種種影響殺菌劑篩選穩(wěn)定性的因素，本試驗以番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌為模式靶標，從接菌濃度、培養(yǎng)時間兩方面對其敏感度的影響因素進行了篩選研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌種 ?番茄早疫病菌（Alternaria solani）和小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）由湖北省生物農藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供，試驗用病原真菌菌種保存溫度為-70 ℃，經(jīng)過活化后，再擴大培養(yǎng)。放線菌和真菌發(fā)酵提取物由湖北省生物農藥工程研究中心先導化合物研究室提供。endprint

1.1.2 ?儀器與試劑 ?儀器、設備主要有臺式高速攪拌機（0-7 000 轉/min）、血球計數(shù)板、光學顯微鏡、高壓滅菌鍋、超聲波振蕩器、電子移液器（MCE8k）、96孔組織培養(yǎng)板（深孔、淺孔）、人工氣候箱（光、溫可調）、無菌操作臺。試劑主要有乙醇、吐溫-80、PDA、PDB培養(yǎng)基，均為市售穩(wěn)定生化試劑;殺菌劑標準樣品有95%嘧菌酯（SIGMA-ALDRICH，C22H17N305）、98%咪鮮胺（SIGMA-ALDRICH，C15H16C13N302）;瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產(chǎn)，型號DH010-4）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?供試病原真菌培養(yǎng)物準備 ?番茄早疫孢子懸浮液制備：取擴大培養(yǎng)3周后的純培養(yǎng)物（直徑9 cm培養(yǎng)皿），在培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，用刮鏟輕刮培養(yǎng)物表面，洗下孢子，制成孢子懸浮液。用細胞計數(shù)板進行孢子計數(shù)。其中混有部分菌絲，用滅菌的醫(yī)用紗布將菌絲過濾掉。小麥穎枯病菌菌絲懸浮液制備：將擴大培養(yǎng)3周后的純培養(yǎng)物（300 mL三角瓶，加入100 mL PDB培養(yǎng)），加入到高速攪拌機中，以5 000 r/min的速度攪拌2 min，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，濾液即為菌絲懸浮液。用細胞計數(shù)板進行碎菌絲計數(shù)。

1.2.2 ?番茄早疫病菌孢子接種濃度選擇試驗[1] ?以標準PDB培養(yǎng)基為基礎，加入0.7%瓊脂配制成感染培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.1中番茄早疫病菌孢子懸浮液中的孢子濃度，用感染培養(yǎng)基（接種溫度55 ℃左右）進行稀釋。孢子濃度分別稀釋為10 000、5 000、2 500、1 250、625、312、156、78個/mL。接種后的培養(yǎng)基分裝到96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中培養(yǎng)，每孔接入0.1 mL，溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度3 000 lx。每個濃度使用8個復孔。從第二天開始持續(xù)觀察真菌生長情況。

1.2.3 ?小麥穎枯病菌碎菌絲接種濃度選擇試驗[2] ?以標準PDB培養(yǎng)基為基礎，加入0.7%瓊脂配制成感染培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.1中小麥穎枯病菌菌絲懸浮液濃度，用感染培養(yǎng)基（接種溫度55 ℃左右）進行稀釋。碎菌絲濃度分別稀釋為100 000、50 000、25 000、12 500、6 250、3 120、1 560、780個/mL。接種后的培養(yǎng)基分裝到96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中培養(yǎng)，每孔接入0.1 mL。培養(yǎng)條件為溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度3 000 lx。每個濃度使用8個復孔。從第二天開始持續(xù)觀察真菌生長情況。

1.2.4 ?番茄早疫病菌對殺菌劑的敏感性試驗[3]

1）殺菌活性評價指標。根據(jù)殺菌活性反應的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記殺菌活性[4]。

2）把兩個標準品配制成母液，濃度為0.2 mg/mL，以含0.05% TW-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。組織培養(yǎng)板中感染培養(yǎng)基加入量為0.09 mL/孔，樣品稀釋液加入量為0.01 mL/孔。每個濃度設4個重復。重復試驗3次。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度3 000 lx。從第二天開始檢查并記錄結果，計算LC50的平均值。

1.2.5 ?番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的不同接菌濃度對微生物源提取物的敏感性試驗[5] ?隨機選擇6批微生物提取物，每批提取物96個樣品，共576個提取物。把提取物配制成母液，濃度為4 mg/mL。以含0.05%TW-80的無菌水稀釋到0.8 mg/mL。組織培養(yǎng)板中感染培養(yǎng)基加入量為0.09 mL/孔，提取物樣品稀釋液加入量為0.01 mL/孔。提取物終濃度為0.08 mg/mL。每個樣品用一個濃度，設3個重復。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度3 000 lx。從第二天開始檢查并記錄活性率。

2 ?結果與分析

2.1 ?番茄早疫病菌孢子接種濃度的選擇結果

每個濃度使用8個復孔，觀察各孔中菌絲生長情況，累計菌絲長滿整個培養(yǎng)基的孔數(shù)。第五天后菌絲過度生長，開始向周圍孔擴散生長，此時停止繼續(xù)觀察。為了便于比較活性情況，理想的孢子接種量應該是在菌絲過度生長前，陰性對照組的菌絲剛剛長滿或者接近長滿時。結果（表1）顯示，孢子接種量為625 和1 250 個/mL時，接近理想接種量。綜合菌絲過度生長的時限，把感染培養(yǎng)時間定為4 d，孢子接種量定為1 000 個/mL。

2.2 ?小麥穎枯病菌碎菌絲接種濃度的選擇結果

每個濃度使用8個復孔，觀察各孔中菌絲生長情況，累計菌絲長滿整個培養(yǎng)基的孔數(shù)。第七天后組織培養(yǎng)板周邊孔內培養(yǎng)基開始失水干裂，所以停止繼續(xù)觀察。為了便于比較活性情況，理想的接種量應該是在菌絲過度生長前，陰性對照組的菌絲剛剛長滿或者接近長滿時。結果（表2）顯示，碎菌絲接種量在25 000 個/mL和50 000 個/mL時，接近理想接種量。綜合菌絲過度生長的時限，我們把感染培養(yǎng)時間定為4 d，接種量定為30 000 個/mL。

2.3 ?番茄早疫病菌對殺菌劑敏感性的試驗效果

根據(jù)2.1的試驗結果，感染培養(yǎng)基中孢子最終濃度為1 000 個/mL。表3顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，嘧菌酯對番茄早疫病菌的LC50快速增大，說明番茄早疫病菌敏感性逐步降低;而咪鮮胺對番茄早疫病菌的LC50緩慢增大，第五天的LC50僅是第二天的兩倍;并且番茄早疫對兩種殺菌劑在相同培養(yǎng)時間的敏感性差別較大。

2.4 ?番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的不同接菌量對微生物源提取物敏感性試驗結果endprint

根據(jù)2.1和2.2的試驗結果，感染培養(yǎng)基中番茄早疫病菌孢子的終濃度設為兩個，分別為10 000 個/mL和1 000 個/mL;小麥穎枯病菌菌絲碎片終濃度分別為100 000 個/mL和30 000個/mL。分別加入提取物樣品，培養(yǎng)4 h后，統(tǒng)計活性樣品檢出率。表4顯示，番茄早疫病菌接種孢子量從10 000個/mL降低到1 000 個/mL時，活性樣品檢出率提高到原來的2倍;小麥穎枯病菌接種碎菌絲量從100 000個/mL降低到30 000個/mL時，活性樣品檢出率提高到原來的3倍。可見降低接菌量可以提高篩選的敏感度。

3 ?小結與討論

殺菌劑標準樣品對番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的活性試驗結果表明，不同病原真菌在篩選中的適宜接種量有較大差異，殺菌活性與供試真菌的接種量和培養(yǎng)時間均呈負相關。應用微生物源提取物進行的篩選試驗也驗證了這一結論。由于農業(yè)病原真菌種類多，殺菌劑先導化合物篩選必須選擇多個模式病原菌進行篩選，才能有效地利用樣品資源[6]。使用半固體培養(yǎng)基法作為初篩方法，可以提高篩選能量，但存在活性不穩(wěn)定的問題，特別是在人工培養(yǎng)基中很難產(chǎn)生孢子的靶標，其菌絲常常相互交織在一起，無法定量接種。通過切斷菌絲，并過濾，可以獲得長度相近的菌絲段，進而實行菌絲定量接種。在菌絲計數(shù)前，培養(yǎng)物在高速轉動的刀片作用下，升溫比較快。同時由于菌絲被切斷時引起的損傷，會使部分碎菌絲失去活力，因此必須控制單次攪拌時間，防止培養(yǎng)物在短時間內升溫過快。由于病原菌對樣品的敏感特異性、接種量、培養(yǎng)時間引起篩選活性樣品檢出率不同，在實際應用中，有必要針對每一個病原真菌，使用適合的接菌量和培養(yǎng)時間?？紤]到活性檢出率過高會增加后續(xù)色譜分析和組分殺菌活性定量分析的工作量，在實際篩選中，把多個靶標的活性樣品檢出率總比例控制在15%以下比較合適。

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[6] 邱立紅，張文吉，王成菊，等.高通量篩選在新農藥創(chuàng)制研究中的應用[J].農藥科學與管理，2002，23（5）：20-24，32.endprint