內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78及caspase-12在SAP大鼠急性肺損傷中的變化

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78及caspase-12在SAP大鼠急性肺損傷中的變化

鄭建興1，任一鵬1，張國志2

(1.河北聯(lián)合大學,河北 唐山 063000;2.河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院普通外科,河北 唐山 063000)

摘要：目的觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)相關蛋白在重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠急性肺損傷(ALI)中的變化，探討ERS是否參與SAP大鼠ALI。方法60只SD雄性大鼠，隨機取30只大鼠采用逆行膽胰管注射?；悄懰徕c的方法制備SAP模型，造模后3、6、12 h三個時間點分批處死大鼠，分別為SAP1組、SAP2組、SAP3組各10只；30只為假手術(sham)組，僅打開腹腔,翻動胰腺組織后關腹，手術后3、6、12 h三個時間點分批處死大鼠，分別為sham1組、sham2組、sham3組各10只。檢測血清淀粉酶、動脈血氣分析、HE染色觀察大鼠肺組織形態(tài)學變化、Western blot法檢測大鼠肺組織GRP78及caspase-12表達情況。結果血清淀粉酶檢測結果顯示，SAP組大鼠各時間點血清淀粉酶較sham組對應時間點顯著升高(P<0.05)，SAP組大鼠各時間點血清淀粉酶呈時相性變化，隨時間逐漸升高(P<0.05)，sham組大鼠各時間點血清淀粉酶比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。動脈血氣分析結果顯示，SAP組大鼠各時間點二氧化碳分壓(PaCO2)較sham組對應時間點顯著升高(P<0.05)，動脈血氧分壓(PaO2)明顯下降(P<0.05)；且SAP模型組按1、2、3組順序，PaCO2逐漸遞增，PaO2逐漸遞減。HE染色結果顯示，sham組大鼠肺組織病理學無明顯變化，SAP組大鼠肺組織損傷逐步加重。Western blot結果顯示，SAP模型組按1、2、3組順序，GRP78及caspase-12表達水平逐漸增高，且SAP模型組明顯高于對應時間點sham組表達水平(P<0.05)，Sham各組之間GRP78及caspase-12表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論ERS可能是SAP急性肺損傷發(fā)病機制之一。

關鍵詞：重癥急性胰腺炎；急性肺損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；GRP78；caspase-12

中圖分類號：R 563.8

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2015.03.017

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床上較為常見的一類急腹癥，起病急、進展快、臨床病理變化復雜。SAP常在發(fā)病早期便會出現(xiàn)急性肺損傷(ALI)，甚至進展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，如果不給予及時有效的治療，可導致患者死亡[1]。國內(nèi)外流行病學資料顯示，ALI發(fā)病率和病死率居高不下，臨床上ALI患者難以救治的重要原因是當前仍未能完全明確ALI的病理生理機制[2]。SAP早期體內(nèi)就會發(fā)生全身炎癥反應綜合征(SIRS)，細胞和組織暴露于缺氧、缺血、再灌注損傷等應激環(huán)境，此時能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)。本研究主要觀察ERS相關蛋白—GRP78及caspase-12的表達變化，探討ERS是否為SAP肺損傷的發(fā)病機制之一。

1材料和方法

1.1　材料

1.1.1主要試劑?；悄懰徕c購于美國Sigma公司，水合氯醛購于天津歐博凱化工有限公司，GRP78、caspase-12購于美國cell signaling公司，β-Tublin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、抗鼠IgG購于碧云天生物技術研究所，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL Plus均購于碧云天生物技術研究所，顯影劑D-72、定影劑D-72購于天津市世紀奧博商貿(mào)有限公司。

1.1.2實驗動物健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250~280 g(河北聯(lián)合大學實驗動物中心提供)。

1.2　方法

1.2.1分組大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組(sham組)和模型組(SAP組)各30只。假手術(sham)組分別于手術后3、6、12 h三個時間點分批處死大鼠，為sham1組、sham2組、sham3組，每組10只；模型組分別于造模后3、6、12 h三個時間點分批處死大鼠，為SAP1組、SAP2組、SAP3組，每組各10只。

1.2.2大鼠模型的建立所有大鼠術前均禁食12 h，自由飲水。SAP組給予水合氯醛3 mL·kg-1，腹腔注射麻醉，經(jīng)上腹正中切口入腹,找到十二指腸，以小號動脈夾分別夾住十二指腸段和肝門部胰膽管，用一次性靜脈留置針經(jīng)十二指腸大乳頭逆行穿刺胰膽管,注射?；悄懰徕c5 g·kg-1,持續(xù)1 min，停留5 min,然后拔出針頭,去除動脈夾，觀察到大鼠胰腺組織明顯水腫、出血,分層縫合腹壁，消毒后將大鼠放入籠中，此時造模成功。假手術組模型的建立：僅打開腹腔,翻動胰腺組織后關腹。兩組大鼠自由飲食、飲水。

1.2.3標本采集

SAP組及Sham組分別于術后第3、6、12 h三個時間點采集頸動脈血0.5 mL，全自動血氣分析儀行動脈血氣分析。再次麻醉,經(jīng)原切口入腹，用采血針從下腔靜脈采血3.5 mL,全自動生化儀檢測血清淀粉酶。

1.2.3.2HE染色

各組大鼠采血后，分別取部分肺組織于4%多聚甲醛溶液中固定，取部分肺組織凍存。4%多聚甲醛溶液固定的肺組織常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡下觀察各時間點肺組織的病理學改變。

1.2.3.3Western blot分析

將凍存肺組織研磨，加入組織裂解液(1 μL·mg-1)裂解蛋白，高速離心(4 ℃、12 000 r·min-1)15 min，留取上清。依據(jù)樣品數(shù)量按試劑A∶試劑B=50∶1配制BCA工作液。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明操作，將蛋白標準品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，加PBS補足至20 μL。樣品孔中加入4 μL待測蛋白，PBS補足到20 μL，每孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃ CO2孵箱中放置30 min。酶標儀測定545 nm波長下蛋白的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度，測定樣品蛋白濃度，根據(jù)上一步所測得的蛋白濃度，取蛋白40~60 μg為上樣量，行SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移,10%脫脂奶粉封閉，加一抗，4 ℃搖床過夜。回收一抗，PBS洗膜3次，10 min/次，加入相應二抗孵育1.5 h，回收二抗，PBS洗膜3次，10 min/次。然后按照BeyoECL Plus說明顯色，X線膠片曝光，將膠片掃描，應用Image J軟件對條帶進行分析。以GAPDH孵育作為內(nèi)參照。

1.3　統(tǒng)計學方法

與公路運輸相比，運行的列車數(shù)量是有限的，因此為了做好鐵路運輸生產(chǎn)控制，最大化鐵路運量與提升運輸效率，保障鐵路運輸安全，需要通過行車調(diào)度工對既有鐵路運輸需求進行市場調(diào)研和分析，預測車流情況，消除生產(chǎn)運輸過程中的安全隱患，更好地提升鐵路運輸質(zhì)量。一般情況下，鐵路運輸?shù)恼{(diào)度工作分為三級調(diào)度層級架構，從高到底分別為行車調(diào)度總體上是對時間和空間的雙重調(diào)度，在時間上要分辨鐵路列車在一定時間內(nèi)的速度和出發(fā)時間，保障鐵路運輸安全[1]。

2結果

2.1　大鼠血清酶學檢測結果

SAP各組大鼠血清淀粉酶(AMY)水平較sham各組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SAP各組大鼠動脈血氧分壓(PaO2)明顯降低，二氧化碳分壓(PaCO2)明顯升高(P<0.05)(Tab.1)。

Tab.1　The value of AMY，PCO 2 and PO 2 in various groups

2.2　大鼠肺組織病理學變化

Sham各組肺組織病理學無明顯變化，大鼠肺組織結構清晰，肺泡壁完整，肺間質(zhì)無滲出。SAP1組大鼠肺組織局部出現(xiàn)輕度充血；SAP2組大鼠肺組織充血逐漸加重，體積逐漸增大，部分肺呈彌漫性出血；SAP3組大鼠肺組織有大面積出血點及瘀血(Fig.1)。

A:Sham;B:SAP1;C:SAP2;D:SAP3. Fig.1　 Histological changes in lung tissues in various groups(HE,×100)

2.3　各組GRP78、caspase-12含量變化

SAP各組GRP78及caspase-12表達水平逐漸升高，且以12 h表達水平最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SAP各組較相對應sham各組GRP78及caspase-12表達水平明顯升高(P<0.05)；sham各組之間GRP78及caspase-12表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(Fig.2,Tab.2)

Fig.2　The expression of GRP78 and caspase-12 in lung tissues of rats in various group

Tab. 2　The expression of GRP78 and caspase-12 in lung tissues of rats in various group

3討論

SAP是臨床上較常見危重疾病，屬于急性胰腺炎的特殊類型，是一種病情險惡、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，該病除引起胰腺局部損傷外，還可以出現(xiàn)胰腺外多器官功能障礙綜合征，ALI和ARDS是最常見的早期并發(fā)癥，SAP患者中大約30%～50%[3]合并有ALI和ARDS，有學者認為ALI/ARDS可以作為臨床評價SAP嚴重程度的標準之一[4]。因此，對SAP合并ALI的診斷、治療和發(fā)病機制的研究已成為SAP研究領域中的一項重要課題。目前SAP合并ALI的發(fā)病機制尚未完全闡明，其發(fā)病機制很多，近年來研究發(fā)現(xiàn)，ERS在機體炎癥反應中發(fā)揮了重要作用，且ERS與炎癥信號轉(zhuǎn)導通路之間相互聯(lián)系，ERS與機體多種疾病密切相關，如糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，其機制可能與ERS誘導細胞凋亡有關[5-6]。本研究從ERS角度探討SAP合并ALI時是否有ERS參與其中。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中蛋白質(zhì)合成、折疊、修飾及細胞內(nèi)鈣貯存的主要場所，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件，但有很多因素可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成ERS。ERS是指由于某種原因使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細胞器病理狀態(tài)，細胞有一套完整的機制來監(jiān)督和幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與修飾,當錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積時，細胞通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑對其進行應答，ERS可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)，從而維持細胞的正常功能[7]。

GRP78屬于熱休克蛋白(HSP70)家族,也稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BiP),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白之一,生理情況下,GRP78在基礎水平表達，對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)具有重要作用，主要功能是作為分子伴侶參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運，通過與ERS元件PERK、IRE1及ATF6的結合抑制ERS的激活[8]。GRP78的誘導廣泛被認為是ERS的標志性分子[9]，ERS被誘導后,未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積,使GRP78從3種跨膜蛋白上解離下來結合未折疊蛋白,解離后的感受蛋白被活化并啟動UPR,減低未折疊或錯誤折疊蛋白在ER內(nèi)的積聚,恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。GRP78是觸發(fā)UPR的關鍵蛋白,顯示出細胞保護的潛在作用,有研究表明細胞過表達GRP78可以有效抵抗ERS[10]。

ERS可以激活多條途徑誘導細胞凋亡,盡管ERS介導的凋亡途徑并沒有完全闡明,但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase-12的活化已經(jīng)被確認參與這個過程[11]。caspase-12是含半胱氨酸殘基的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員之一，隨著ERS成為目前研究的熱點，作為其凋亡途徑之一的caspase-12激活受到了更大程度的關注。caspase-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜,是介導ERS凋亡的關鍵蛋白酶,在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化,是ERS特有的凋亡途徑。

為觀察ERS相關蛋白GRP78及caspase-12在SAP大鼠ALI中的表達變化特點,我們選擇了經(jīng)大鼠胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c溶液方法制備SAP動物模型[12]。該方法構建大鼠SAP并發(fā)ALI模型是研究SAP引起ALI的理想動物模型[12],但此方法制備大鼠SAP模型時大鼠病死率高，不便長時間觀察，故本研究選擇在造模成功后12 h內(nèi)完成。為證實SAP模型大鼠是否并發(fā)ALI,我們在光鏡下初步比較了SAP組和sham組大鼠肺組織病理改變情況，在SAP組大鼠肺組織HE染色病理切片觀察到SAP1組大鼠肺組織局部出現(xiàn)輕度充血，SAP2組大鼠肺組織充血逐漸加重，體積逐漸增大，部分肺呈彌漫性出血，SAP3組大鼠肺組織有大面積出血點及瘀血；而sham組大鼠各組肺組織病理學均無明顯變化，大鼠肺組織結構清晰，肺泡壁完整，肺間質(zhì)無滲出。上述實驗結果說明，我們成功構建了SAP并發(fā)ALI大鼠模型,SAP模型肺臟組織出現(xiàn)了ALI表現(xiàn),因而SAP組肺臟組織可進一步用于實驗的分子檢測。造模成功后取靜脈血行血清淀粉酶檢測，SAP組大鼠血清淀粉酶在造模成功后3、6、12 h較相對應時間點sham組大鼠血清淀粉酶明顯升高，且SAP組大鼠血清淀粉酶水平隨造模后時間延長而逐漸升高，sham組大鼠各時間點血清淀粉酶無明顯變化。血氣分析提示，SAP組大鼠各時間點PaCO2較sham組對應時間點顯著升高(P<0.05)，PaO2明顯下降(P<0.05)；且SAP組按1、2、3組順序，PaCO2逐漸遞增，PaO2逐漸遞減；sham組各時間點PaO2及PaCO2差異無顯著性。

綜上所述，本研究選取ERS發(fā)生的標志性分子GRP78及介導ERS凋亡的關鍵蛋白酶caspase-12，用Western blot法檢測大鼠肺組織GRP78及caspase-12的表達情況，發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠GRP78及caspase-12均逐漸增高，且增高水平明顯高于相對應時間點的sham組，GRP78的增高提示ERS可能參與了SAP大鼠ALI，并且在ERS過程中caspase-12水平隨時間逐漸增加，引起了肺泡上皮細胞的凋亡，導致肺組織病理學變化逐漸加重。

SAP大鼠導致ALI的發(fā)生機制有很多，ERS可能為其一，因此，對過度的ERS早期進行干預可能成為治療SAP導致ALI的新方法,仍需要我們進一步研究。

參考文獻：

[1]劉丙剛，秦春宏.重癥急性胰腺炎致肺損傷發(fā)病機制研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26(3)：393-395.

[2]Erickson S E，Martin G S，Davis J L，et al.Recent trends in acute lung injury mortality：1996—2005[J].Crit Care Med，2009，37(5)：1574-1579.

[3]李成玉.內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷模型的建立[J].臨床肺科雜志，2012，17(4)：657-659.

[4]王靜宜.依達拉奉對肺損傷保護作用的研究進展[J].臨床肺科雜志，2012，17(7)：1300-1301.

[5]Gotoh T，Endo M，Oike Y.Endoplasmic reticulum stress-related inflammation and cardiovascular diseases[J].Int J Inflam，2011，2011:259462.

[6]Papa F R.Endoplasmic reticulum stress，pancreatic β-cell degeneration，and diabetes[J].Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2(9):a007666.

[7]Malhotra J D，Miao H，Zhang K，et al.Antioxidants reduce endoplasmic reticulum stress and improve protein secretion[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：18525-18530.

[8]Rao R V，Peel A，Logvinova A，et al.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program:Role of the ER chaperone GRP78[J].FEBS Lett，2002，514(23):122-128.

[9]Ni M,Lee A S.ER chaperones in mammalian development and human diseases[J].FEBS Lett,2007,581(19):3641-3651.

[10]Morris J A,Dorner A J,Edwards C A,et al.Immunoglobulin binding protein(BiP)function is required to protect cells from endoplasmic reticulum stress but not required for the secretion of selective proteins[J].J Biol Chem,1997,272(7):4327-4334.

[11]Zhang K,Kaufman R J.The unfolded protein response:A stress signaling pathway critical for health and disease[J].Neurology,2006,66(2 Suppl 1):S102-S109.

[12]Kim H S,Christine C,Christopher C.Review of experimental animal models of acute pancreatitis[J].HPB(Oxford)，2006,8(4)：264-286.

[責任編輯：李薊龍]