子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用①

李斯晨　劉　　肖　雪

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心,廣州510150)

[摘　要]　目的：探究子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用。方法：本研究選取2013年1月至2014年1月于我院診治，并經(jīng)病理活檢證實(shí)為子宮頸癌的患者200例作為觀察組，同時(shí)，隨機(jī)選取200例健康婦女為對照組。兩組均在入院時(shí)取外周血2 ml，采集觀察組的宮頸細(xì)胞樣品用來進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察和HPV的DNA探查，觀察兩組人員HPV感染率和HLA分型。結(jié)果：兩組入組人員HPV感染陽性率分別為91%、16%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17、HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率分別為41%、39%、35%、15%、53%，對照組分別為18%、15%、14%、52%、89%，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17分布頻率明顯高于對照組，HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率明顯低于對照組。結(jié)論：在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程中，存在HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17等位基因易感，而HLA-KIR*02、HLA-KIR*12等位基因可減少宮頸癌的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]　子宮頸癌；人類白細(xì)胞抗原(HLA)；NK；免疫應(yīng)答

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.020

子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用①

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心,廣州510150)

[摘要]目的：探究子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用。方法：本研究選取2013年1月至2014年1月于我院診治，并經(jīng)病理活檢證實(shí)為子宮頸癌的患者200例作為觀察組，同時(shí)，隨機(jī)選取200例健康婦女為對照組。兩組均在入院時(shí)取外周血2 ml，采集觀察組的宮頸細(xì)胞樣品用來進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察和HPV的DNA探查，觀察兩組人員HPV感染率和HLA分型。結(jié)果：兩組入組人員HPV感染陽性率分別為91%、16%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17、HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率分別為41%、39%、35%、15%、53%，對照組分別為18%、15%、14%、52%、89%，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17分布頻率明顯高于對照組，HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率明顯低于對照組。結(jié)論：在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程中，存在HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17等位基因易感，而HLA-KIR*02、HLA-KIR*12等位基因可減少宮頸癌的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]子宮頸癌；人類白細(xì)胞抗原(HLA)；NK；免疫應(yīng)答

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.020

中圖分類號①本文受廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(WSTJJ20121108440102 197212313220)資助。;②廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科，廣州510510。

作者簡介：李斯晨(1972年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病臨床工作，同時(shí)供職于廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510150，E-mail:lisichen121@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate the effect of HLA genetic susceptibility and NK cell receptors and immune response on the occurrence and development of the Cervical cancer.Methods: Select the 200 patients confirmed by the pathological biopsy in our hospital from January 2013 to January 2014 as the observation group.At the same time,randomly select the 200 healthy women as the control group.Both of them blood 2 ml peripheral blood,sample the cervical cell from the observation group.Having the cytological observation and the DNA′s probe of the HPV,observe two group′s HPV infection rates and HLA′s parting.Results: The HPV infection rates of the observation group is 91%,and the rates of the control group is 16%.The differences between them were all significant(P<0.05).The HLA-KIR*1003,HLA-KIR*14,HLA-KIR*17,HLA-KIR*02,HLA-KIR*12 distribution frequency of the observation group are 41%,39%,35%,15%,53%.The HLA-KIR*1003,HLA-KIR*14,HLA-KIR*17,HLA-KIR*02,HLA-KIR*12 distribution frequency of the control group are 18%,15%,14%,52%,89%.The differences between them were all significant(P<0.05).Among them The HLA-KIR*1003,HLA-KIR*14,HLA-KIR*17 distribution frequency of the observation group are significantly higher than the control group,HLA-KIR*02,HLA-KIR*12 distribution frequency of the observation group are significantly lower than the control group.Conclusion: During the occurrence and development of the Cervical cancer,the HLA-KIR*1003,HLA-KIR*14,HLA-KIR*17 may be the risk factors for the Cervical cancer;the HLA-KIR*02,HLA-KIR*12 may be the protective factors for the Cervical cancer.

Cervical carcinoma HLA gene susceptibility and NK cell receptor immune responses

LISi-Chen，LIULi，XIAOXue.ReproductiveCenter，theThirdHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510150，China

[Key words]Cervical cancer;Human leukocyte antigen,HLA;NK(Nature killer cell);Immune responses

子宮頸癌是較為常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，其中發(fā)展中國家發(fā)病率較高，有資料顯示，大于85%的子宮頸癌新發(fā)及死亡病例在發(fā)展中國家，其中印度占27%[1]。在我國，農(nóng)村的發(fā)病率遠(yuǎn)高于城市[2]，主要原因在于對子宮頸癌預(yù)防及早期篩查的認(rèn)識不足。目前認(rèn)為，子宮頸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中，一致認(rèn)為子宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關(guān)[3]，而HLA基因與HPV感染及子宮頸癌的發(fā)生均有一定的關(guān)聯(lián)。人乳頭瘤病毒(HPV)是一類特異性感染人皮膚、黏膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，是空病毒科多瘤病毒亞科，其分子量約為8 000 bp。人是HPV病毒的唯一宿主，其致癌作用與HPV具有DNA整合作用有關(guān)[4]。不同個(gè)體感染HPV后，其臨床表現(xiàn)及預(yù)后也不完全相同。多數(shù)感染可被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，只有少數(shù)感染可持續(xù)發(fā)展成子宮頸癌，其中免疫低下人群風(fēng)險(xiǎn)增高[5]。因此認(rèn)為自身免疫因素在疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著決定性作用。

大量研究發(fā)現(xiàn)HLA基因的高度多態(tài)性與腫瘤的易感性有關(guān)，如肺癌、甲狀腺癌、宮頸癌、非霍金式淋巴瘤等等[6,7]。人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)是人類的主要組織相容性復(fù)合體，人類白細(xì)胞抗原等位基因系統(tǒng)是人類已知最復(fù)雜的顯性多態(tài)遺傳系統(tǒng)[8]。多數(shù)宮頸癌細(xì)胞存在HLA基因型突變，HLA對抗原的加工和遞呈作用，可能是影響機(jī)體對HPV的清除的因素。為進(jìn)一步探究子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用，選取2013年1月至2014年1月于我院診治，并經(jīng)病理活檢證實(shí)為子宮頸癌的患者200例，同期，選取200例健康婦女為對照組，兩組均在入院時(shí)取外周血2 ml，采集觀察組的宮頸細(xì)胞樣品用來進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察和HPV的DNA探查，觀察兩組人員HPV感染率和HLA分型進(jìn)行分析。現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料本研究選取2013年1月至2014年1月于我院診治，并經(jīng)病理活檢證實(shí)為子宮頸癌的患者200例，其中鱗狀細(xì)胞癌患者109例，鱗癌Ⅰ級32例，鱗癌Ⅱ級患者53例，鱗癌Ⅲ級患者24例，腺癌患者91例，年齡25～80歲，平均年齡(49.63±10.29)歲，病程1~5年，平均(2.15±1.02)年，同時(shí)，選取200例健康婦女為對照組，年齡25～80歲，平均年齡(48.06±9.64)歲，無惡性腫瘤病史，兩組患者在年齡、所在區(qū)域、孕次、產(chǎn)次、種族等方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有高度可比性，所有入組患者在入院時(shí)取2 ml外周血，凍存?zhèn)錅y。

1.2病例納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)①經(jīng)病理確定的宮頸上皮細(xì)胞癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌。②臨床分期為Ⅰ~Ⅳ期，經(jīng)過至少由2名具有婦科腫瘤資質(zhì)的副主任醫(yī)師婦檢確定；③無明顯化療、放療禁忌癥；④經(jīng)患者知情同意并簽署化療、放療同意書。

1.2.2對照組納入標(biāo)準(zhǔn)①健康婦女，無惡性腫瘤病史；②經(jīng)志愿者同意并簽署知情同意書。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟①DNA提?。翰捎梅勇确路椒ㄈ崛NA。經(jīng)Pharmacia Biotech Gene Quant II RNA/DNA Calculator測定DNA樣本濃度為50～100 ng/μl，純度A260/A280為0.9～1.6。使用來自于國際組織相容性協(xié)會的18份標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA。②PCR產(chǎn)物的純化：在10 μl的PCR產(chǎn)物中加入1 U堿性磷酸酶和2 U切核酸酶I(USB Corp,Cleveland,OH,USA)，混勻，37℃ 30 min，80℃ 15 min。③測序反應(yīng):使用ABI PRISM BigDye(FS PE Biosystems)測序試劑盒，取純化的PCR產(chǎn)物約50ng進(jìn)行測序反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)MICA基因第2,3外顯子的正反向序列1F(5′-ATTTCCTGCCCCAGGAAGGTTGG)和2R(5′-CAACTCTAGCAGAATTGGAGGGAG),第4,5外顯子的正反向序列3F(5′-AAGAGAAACAGCCCTGTTCCTCTCC)和 4R(5′-GATGCTGCCCCCATTCCCTTCCCAA)。在ABI 3130基因分析儀(PE Biosystems)上進(jìn)行測序。巢式引物用于測序，使用引物-特異性引物對(單倍體型特異性核酸序列)來定義多態(tài)位點(diǎn)的cis/trans的結(jié)合點(diǎn)。 PCR產(chǎn)物用Exosap IT(USB,Amersham Biosciences,USA)提純。DNA測序用Big Dye Terminator Cycle排序標(biāo)準(zhǔn)試劑盒-3.1版本(Applied Biosystems,USA)進(jìn)行測序。依據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書用巢式引物從內(nèi)含子5到UTR3在ABI Prism 770基因分析儀上進(jìn)行反應(yīng)(Applied Biosystems,USA)。④HLA的分型及差異鑒定：(1)對所有入選病例提取的DNA采用PCR-SBT，擴(kuò)增DNA，對DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測；(2)采用特定的HLA分析軟件，對HLA進(jìn)行初步分型，鑒定病例對照組的差異HLA類型，再對其進(jìn)行高分辨的分型，確定具體的HLA等位基因/單倍型。(3)選擇50例病患進(jìn)行HLA表達(dá)檢測，并采用原位雜交技術(shù)檢測具體表達(dá)位置。

1.4標(biāo)本收集方法采集病例組的宮頸細(xì)胞樣品用來進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的觀察和HPV的DNA探查，所有入選病例組和對照組在入院時(shí)取外周血2 ml放入-20℃凍存?zhèn)錅y，宮頸癌患血樣品和宮頸細(xì)胞樣品是在診斷的當(dāng)天治療開始之前收集的。

1.5觀察指標(biāo)①兩組人員HPV感染率；②兩組人員HLA分型；

1.6統(tǒng)計(jì)分析方法本研究采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　HPV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoregram of DNA amplification of HLANote: 1-6.Cervical specimens；7-9.Control specimens；10.Negative control；M.Molecular weight marker.

表1　兩組入組人員HPV感染率比較(n)Tab.1　Compare infection rate with two groups(n)

圖2　HLA-KIR等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2　Electrophoregram of PCR amplification of HLA-KIR′s allelesNote: A.Control group of the HLA-KIR alleles results,and c is a positive control;Negative control.the negative control for each alleles;B.Observation group HLA-KIR allele results.

圖3　觀察組標(biāo)本的HLA-KIR*1003基因測序結(jié)果Fig.3　HLA-KIR * 1003 gene sequencing results of observation group specimens

表2　觀察組與對照組基因分布頻率分析Tab.2　Distribution of HLA-KIR alleles of observation group and control group

2結(jié)果

2.1兩組入組人員HPV感染率比較HPV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為150 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。兩組入組人員HPV感染陽性率分別為91%、16%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表1。

2.2觀察組與對照組基因分布頻率分析對所有入選病例提取的DNA采用PCR-SBT，擴(kuò)增DNA，對DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并進(jìn)行基因測序。見圖2、3。觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17、HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率分別為41%、39%、35%、15%、53%，對照組分別為18%、15%、14%、52%、89%，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中觀察組患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17分布頻率明顯高于對照組，HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率明顯低于對照組，如表2。

3討論

隨著醫(yī)學(xué)與社會科學(xué)的不斷發(fā)展，子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降，盡管如此，但宮頸癌的生存率及生存質(zhì)量仍不盡人意,在我國，宮頸癌的每年新發(fā)病例約11萬，每年約有3萬女性死于宮頸癌[9]。因此有必要對宮頸癌的易感、發(fā)生發(fā)展及其影響預(yù)后的機(jī)制進(jìn)行深入研究。NK細(xì)胞在天然免疫中發(fā)揮著非常重要的作用,可以有效地識別和清除病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞，其受體主要分為兩大類:抑制性受體和活化性受體。這兩大類受體分別向胞內(nèi)傳遞抑制信號和活化信號,當(dāng)NK細(xì)胞接受的抑制性信號大于活化性信號時(shí),NK細(xì)胞處于抑制狀態(tài),不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答;當(dāng)NK細(xì)胞處于活化狀態(tài),能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,識別并清除病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞。

子宮頸癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的復(fù)雜過程，研究表明人類乳頭瘤狀病毒(HPV)是宮頸癌發(fā)生的主要病因，大約99%子宮頸癌是由高危型HPV持續(xù)感染所致[10]。不同的個(gè)體感染HPV后，臨床表現(xiàn)和預(yù)后存在差異，大部分HPV感染患者無臨床癥狀，HPV感染可被機(jī)體自然消除，但小部分感染仍持續(xù)存在，在一些其他因素(如吸煙、性傳播疾病等)作用下，誘發(fā)子宮頸癌的發(fā)生[11]。但是在致癌的過程中除了HPV的感染和持續(xù)存在，還有很多其他因素參與了子宮頸上皮細(xì)胞的癌變過程[12]。HPV自上世紀(jì)90年代Wank等發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原與子宮頸癌相關(guān)以來，宮頸癌與HLA基因易感的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。人類白細(xì)胞抗原HLA作為機(jī)體的免疫核心分子，在HPV的清除和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13]。HLA分子將病毒肽提呈給T細(xì)胞的過程亦受到HLA及HPV基因多態(tài)性雙重影響，HLA分子能否將病毒肽正確提呈給免疫細(xì)胞并引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答對疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著重要影響。

本研究為探究子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中HLA基因易感及NK細(xì)胞受體免疫應(yīng)答的作用，比較分析宮頸癌患者與正常婦女的HPV感染率和HLA分型發(fā)現(xiàn)患者HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17分布頻率明顯高于對照組，HLA-KIR*02、HLA-KIR*12的分布頻率明顯低于對照組。綜上所述，可認(rèn)為在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程中，HLA-KIR*1003、HLA-KIR*14、HLA-KIR*17等位基因可能是宮頸癌的發(fā)生危險(xiǎn)因素，HLA-KIR*02、HLA-KIR*12等位基因是宮頸癌的保護(hù)因素。但這以結(jié)論尚需大規(guī)模前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證，以期為子宮頸癌的早期病變篩查和預(yù)防提供有力依據(jù)，從源頭上進(jìn)行減少患者的發(fā)病率和死亡率。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉昱,祁文娟,魏麗惠.HPV預(yù)防性疫苗在預(yù)防子宮頸癌中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2013,14(4):378-379.

[2]趙方輝,胡尚英,張思維,等.2004-2005年中國居民子宮頸癌死亡情況及30年變化趨勢[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,44(5):408-412.

[3]李斯晨,劉瓅,肖雪.HLA-KIR-MICA基因及其NK受體免疫應(yīng)答與子宮頸癌的相關(guān)性[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2014,21(5):537-538.

[4]夏小艷,瑪依努爾·尼亞孜.HPV及HLA與宮頸癌關(guān)系研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,10(8):1566-1569.

[5]杜洋,董玉貞,王慧敏,等.遼寧地區(qū)婦女宮頸癌與人類白細(xì)胞抗原DRB1-15等位基因的關(guān)系[J].中外婦兒健康,2011,19(6):63-64.

[6]Wang SS,Abdou AM,Morton LM,etal.Human leukocyte antigen class I andⅡalleles in non-Hodgkin lymphoma etiology[J].Blood,2010,115(23):4820-4823.

[7]Amoli MM,Yazdani N,Amiri P,etal.HLA-DR association in papillary thyroid carcinoma[J].Dis Markers,2010,28(1):49-53.

[8]李華,百合尼莎·阿不都熱西提,張?zhí)K琴,等.喀什維吾爾族婦女宮頸癌與HLA-DRB1*15和HLA-DRB1*04的關(guān)系[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,28(7):555-559.

[9]張凱,孫萍,郭蘭偉,等.中國北方漢族女性HLA-DP/DQ基因多態(tài)性與宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究[J].中國腫瘤,2013,22(6):442-447.

[10]唐雋,郝飛.HPV逃避宮頸癌宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制[J].免疫學(xué)雜志,2011,28(7):625-629.

[11]樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004：285-294.

[12]Ferreira da Silva I,Koifman RJ,Quinto-Santos SC,etal.TP53 genetic polymorphisms and environmental risk factors associated with cervical carcinogenesis in a cohort of brazilian women with cervical lesions[J].Journal of Toxicology and Environmental Health,Part A,2010,73(13-14):888-900.

[13]尹春梅,姚宇峰,楊宏英,等.HLA基因多態(tài)性與宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].微循環(huán)學(xué)雜志,2014,24(2):69-72.

[收稿2014-11-20修回2015-01-16]

(編輯許四平)