沉默GRP78/BIP表達(dá)對人膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響及機(jī)制①

伍家燕　樊建軍　曾　帆　李海玉　李　韻　張寒韜　白　鑫　劉革力　宋方洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子腫瘤研究中心,重慶400016)

[摘　要]　目的：探討體外沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/BIP表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響及可能機(jī)制。方法：設(shè)計(jì)、合成靶向GRP78基因的小干擾RNA，利用脂質(zhì)體Liopfecta mineRNAIMAX轉(zhuǎn)染入膀胱癌T24細(xì)胞，分別采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平檢測細(xì)胞內(nèi)GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表達(dá)，采用Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測沉默GRP78表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)(siRNA-GRP78)T24細(xì)胞中GRP78表達(dá)顯著降低，細(xì)胞侵襲遷移能力明顯受到抑制，MMP2、MMP9表達(dá)降低，而Timp-2表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：沉默GRP78能明顯抑制人膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，其機(jī)制可能與影響MMP2、MMP9、Timp-2表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]　GRP78；膀胱癌；侵襲與遷移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

·生物治療·

沉默GRP78/BIP表達(dá)對人膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響及機(jī)制①

伍家燕樊建軍曾帆李海玉李韻張寒韜白鑫劉革力宋方洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子腫瘤研究中心,重慶400016)

[摘要]目的：探討體外沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/BIP表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響及可能機(jī)制。方法：設(shè)計(jì)、合成靶向GRP78基因的小干擾RNA，利用脂質(zhì)體Liopfecta mineRNAIMAX轉(zhuǎn)染入膀胱癌T24細(xì)胞，分別采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平檢測細(xì)胞內(nèi)GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表達(dá)，采用Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測沉默GRP78表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移的影響。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)(siRNA-GRP78)T24細(xì)胞中GRP78表達(dá)顯著降低，細(xì)胞侵襲遷移能力明顯受到抑制，MMP2、MMP9表達(dá)降低，而Timp-2表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：沉默GRP78能明顯抑制人膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，其機(jī)制可能與影響MMP2、MMP9、Timp-2表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]GRP78；膀胱癌；侵襲與遷移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

中圖分類號①本文為高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.20125503110012)。

作者簡介：伍家燕(1989年-)，女，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。

通訊作者及指導(dǎo)教師：宋方洲(1957年-)男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)、基因治療的研究，E-mail:fzsongcq@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate effect of silencing GRP78 in the invasion and metastasis of Bladder cancer T24 cells and the possible mechanism.Methods: The siRNA targeting GRP78 gene was chemically synthesized,and transfect into human bladder cancer T24 cells by Liopfecta mineRNAIMAX.The mRNA and protein expression levels of GRP78,MMP2,MMP9 and Timp-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.Transwell assay and Scratch Wound Assay were conducted to deter mine the potency of migration and invasion of T24 cells.Results: The expression of AEG1 mRNA and protein were significantly down-regulated in T24 cells transfected with siRNA targeting GRP78 as compared with the control group(P< 0.01);so was expression levels of MMP2 and MMP9 protein(P< 0.05);but timp-2 expression was up-regulated.Cell migration and invasion capacity of T24 cells tranfected with GRP78siRNA group had lower than the cells in the transfection with siRNA-control group(P<0.05).Conclusion: GRP78 functions as a positive regulator in the invasion and metastasis of bladder cancer cells,and may be involved in the expression of MMP2,MMP9 and Tipm-2.

Effect of GRP78 silencing on invasion and migration abilities of human Bladder cancer T24 cells

WUJia-Yan,FANJian-Jun,ZENGFan,LIHai-Yu,ZHANGHan-Tao,BAIXin,LIUGe-Li,SONGFang-Zhou.MolecularMedicineandTumorResearchCenter,BasicMedicalCollege,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Key words]GRP78；Bladder cancer；Invasion and migration

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第一位[1]。資料顯示膀胱癌的發(fā)病率與患者的年齡、性別、職業(yè)密切相關(guān)，而復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移則是導(dǎo)致膀胱癌患者總體病死率居高不下的首要原因[2]。因此，針對尋找和開發(fā)新的膀胱癌治療的方法和分子靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的重要課題。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein，GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，協(xié)助蛋白的折疊、合成以及轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)其參與了細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)以及免疫應(yīng)答等過程[3,4]。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)GRP78與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌及食管癌等腫瘤發(fā)現(xiàn)其呈高表達(dá)趨勢[5-7]，且與腫瘤的分級與臨床分期顯著相關(guān)[8]，而針對GRP78生物學(xué)功能研究已經(jīng)引起眾多學(xué)者的廣泛重視。 康鄭軍等研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷(Icariin，ICA)可通過抑制GRP78的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)人膀胱癌BIU87細(xì)胞凋亡[9]，然而GRP78在膀胱癌細(xì)胞中具體作用及機(jī)制卻鮮為人知，本研究在人膀胱癌T24細(xì)胞中通過靶向沉默GRP78表達(dá)，探討其對侵襲遷移能力的影響及可能機(jī)制，為膀胱癌的早期診斷及基因靶向分子治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑Lipofecta mineRNAIMAX轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，TotalRNA提取試劑盒購自美國Omega公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物，兔抗人GRP78一抗購自美國Abcam公司，兔抗人MMP2、MMP9一抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人Timp-2一抗購自武漢博士德生物公司，GAPDH一抗購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。GRP78-siRNA序列(5′-AUAACAUUUAGGCCAGCAAUAGUUC-3′)由上海吉瑪公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤研究中心儲存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前消化收集細(xì)胞計(jì)數(shù)3×105個(gè)提前24 h接種入6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70%~80%時(shí)按脂質(zhì)體Lipofecta mineRNAIMAX說明書分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-GRP78，培養(yǎng)48 h提取Total RNA，72 h提取總蛋白。

1.3Real-time PCR法細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于擴(kuò)GRP78目的片段的上游引物為：5′-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3′,下游引物為：5′-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3′；β-actin上游引物為：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，β-actin上游引物為：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算并分析。

1.4Western blot法細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，加入適量的上樣緩沖液，100℃煮沸變性5 min，采用50 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)印膜上，5%脫脂奶粉TBST液封閉2 h；分別將兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人GRP78一抗(1∶1 000)、兔抗人Timp-2一抗(1∶500)、兔抗人MMP2一抗(1∶500)和兔抗人MMP9一抗(1∶500)4℃孵育過夜；TBST反復(fù)清洗4次，每次約10 min；羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育60 min；用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)量。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)將6孔板中轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用200 μl的槍頭劃痕，PBS沖洗3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，第二天更換無血清培養(yǎng)基，于鏡下觀察劃痕愈合程度，根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)將4℃過夜后Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8 稀釋，混勻后，在Transwell小室上室加入60 μl混合液，于孵箱靜止4~6 h，將轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，加入含5%FBS培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)/100 μl加入Transwell上室中，下室加入含25%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h，用棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞，PBS清洗3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，洗凈風(fēng)干后，顯微鏡下選取隨機(jī)3個(gè)視野計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1沉默GRP78基因在膀胱癌T24細(xì)胞中的鑒定Real-time PCR、Western blot結(jié)果顯示，siRNA-NC組GRP78表達(dá)水平明顯高于siRNA-GRP78組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示GRP78表達(dá)被有效沉默，見圖1、2。

2.2沉默GRP78基因?qū)?xì)胞遷移及侵襲能力的影響

2.2.1Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鏡下siRNA-GRP78組中穿過小室基底膜的細(xì)胞明顯較siRNA-NC組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖3,提示沉默GRP78表達(dá)可有效抑制T24細(xì)胞的侵襲能力。

圖1　Real-time PCR mRNA水平檢測沉默GRP78表達(dá)Fig.1　mRNA expression of silencing GRP78 was detected by Real-time PCRNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

圖2　免疫印跡法檢測蛋白水平檢測沉默GRP78表達(dá)Fig.2　Protein expression of silencing GRP78 was detected by Western blot

圖3　沉默GRP78表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.3　Effect of silencing GRP78 expression was detected by Transwell assay on the cell invasion of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

圖4　沉默GRP78表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4　Effect of silencing GRP78 expression was detected by wound healing test on cell migration of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

2.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同時(shí)間下siRNA-GRP78組中細(xì)胞愈合程度明顯低于siRNA-NC組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)，提示沉默GRP78表達(dá)可有效抑制T24細(xì)胞的遷移能力。

圖5　沉默GRP78表達(dá)對MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響Fig.5　Effects of silencing GRP78 on expression of MMP2 and MMP9 in T24 cells

圖6　沉默GRP78表達(dá)對Timp-2蛋白表達(dá)的影響Fig.6　Effects of silencing GRP78 on expression of TIMP-2 protein in T24 cells

2.3沉默GRP78基因?qū)24細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP78組中MMP2、MMP9蛋白表達(dá)明顯減少，提示沉默GRP78表達(dá)可有效抑制MMP2、MMP9蛋白表達(dá)(圖5)。

2.4沉默GRP78基因?qū)24細(xì)胞組織金屬蛋白酶抑制劑Timp-2蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP78組中Timp-2蛋白表達(dá)明顯增加，提示沉默GRP78表達(dá)可促進(jìn)Timp-2表達(dá)(圖6)。

3討論

腫瘤的侵襲與遷移依賴于腫瘤細(xì)胞基底膜完整性的破壞以及腫瘤微血管的形成[10]。金屬基質(zhì)蛋白酶(Matrix metallo-proteinases，MMPs)是一組重要的降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，研究發(fā)現(xiàn)MMPs表達(dá)與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[11]，MMP2、MMP9是其家族重要成員，有學(xué)者證實(shí)膀胱癌組織中MMP-2、MMP-9基因的表達(dá)水平與膀胱癌組織的病理分級分期密切相關(guān)[12]，高M(jìn)MP-2陽性表達(dá)率和/或低TIMP-2陽性表達(dá)率與膀胱癌浸潤及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)以及術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[13]。Timp-2是組織金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成員之一，可特異性結(jié)合MMPs，進(jìn)而抑制MMPs的活性，Timps與MMPs的動(dòng)態(tài)平衡的打破是腫瘤細(xì)胞惡性侵襲與遷移的標(biāo)志[14]。

在本研究中，通過體外設(shè)計(jì)合成靶向GRP78的小干擾RNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入膀胱癌T24細(xì)胞中，Transwell與劃痕實(shí)驗(yàn)探討了沉默GRP78表達(dá)對T24細(xì)胞侵襲與遷移的影響。結(jié)果顯示，沉默GRP78表達(dá)后，siRNA-GRP78組中穿過小室基底膜的細(xì)胞量明顯減少，而劃痕后愈合速度也明顯降低，提示沉默GRP78可有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞的侵襲與遷移能力。而我們進(jìn)一步通過免疫印跡法檢測了沉默GRP78表達(dá)后，MMP2、MMP9和Timp-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示siRNA-GRP78組中MMP2、MMP9蛋白表達(dá)明顯減少，Timp-2蛋白水平明顯增加，提示沉默GRP78表達(dá)可能通過調(diào)控MMP2、MMP9和Timp-2表達(dá)，進(jìn)而抑制T24細(xì)胞的侵襲遷移能力，而GRP78如何通過靶定相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子或轉(zhuǎn)錄因子來發(fā)揮調(diào)控作用，其機(jī)制有待于我們進(jìn)一步的研究。

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[收稿2015-06-25修回2015-07-15]

(編輯許四平)

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