反相液相色譜中調(diào)整流動(dòng)相組分比例對(duì)分離效果的影響

反相液相色譜中調(diào)整流動(dòng)相組分比例對(duì)分離效果的影響

黃強(qiáng)1李華勇1劉新國2

(1.江西省吉安市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心，江西 吉安 343000；

2.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院，江西 南昌 33000)

摘要：用國標(biāo)法同時(shí)測(cè)定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，通過改變流動(dòng)相組分比例，即改變流動(dòng)相極性，對(duì)三種比例所得出的分離效果進(jìn)行比較，考察了三種組分的保留時(shí)間、分離度及拖尾因子等參數(shù)變化。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)增加甲醇比例，三種待測(cè)組分保留時(shí)間都提前，且糖精鈉的變化最大；(2)增加甲醇比例可以使三種組分的分離度和拖尾因子都變小，同時(shí)也可以滿足對(duì)分離度的要求；(3)綜合分析試驗(yàn)所得各參數(shù)，得出色譜系統(tǒng)所需最適流動(dòng)相配比，實(shí)現(xiàn)較好的分離效果，試驗(yàn)的精密度也滿足要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜流動(dòng)相分離度系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的一種色譜分離模式，是基于樣品中的不同組分和固定相之間作用的不同而將各組分分離，具有柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚等特點(diǎn)，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。反相色譜系統(tǒng)中的固定相一般采用硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)，在一些大分子物質(zhì)的分離中，多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液，添加一定量的乙腈或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)參數(shù)。其中，分離度和拖尾因子是考察分離效果的重要指標(biāo)。實(shí)際檢測(cè)中，各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。

筆者根據(jù)自己多年該方面工作的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，以國標(biāo)法測(cè)定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉為試驗(yàn)方法。在色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)時(shí)，通過改變甲醇在流動(dòng)相中的比例，實(shí)現(xiàn)了待測(cè)組分較好的分離效果。

1、材料與方法

1.1　儀器與試劑

島津LC-2010A型高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器，色譜工作站。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度均為0.100 mg/mL。

乙酸銨為分析純，甲醇為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2　儀器工作條件

色譜柱為C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為230 nm；流動(dòng)相為甲醇與0.02 mol/L乙酸銨的混合溶液；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3　試驗(yàn)方法

本文試驗(yàn)采用GB/T 23495-2009中對(duì)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的測(cè)定方法，甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液分別過0.45 μm微孔濾膜，通過改變甲醇與乙酸銨溶液的體積比來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，采用甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液體積比分別為：5：95、10：90和15：85三種比例來進(jìn)行，將苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，比較不同比例下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中三種組分的保留時(shí)間、分離度及拖尾因子等參數(shù)的變化。

2、結(jié)果與討論

2.1　流動(dòng)相比例的選擇

調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，一方面以組分比例較低者(小于或等于50%)相對(duì)于自身的改變量不超過±30%且相對(duì)于總量的該變量不超過±10%為限，如30%相對(duì)改變量的數(shù)值超過總量的10%時(shí)，則改變量以總量的±10%為限；另一方面，對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%。故本文采用5：95、10：90和15：85三種比例來進(jìn)行。

2.2　三種組分保留時(shí)間的變化

保留時(shí)間是待測(cè)組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間。理論上來說，保留時(shí)間越長越有利于組分分離，但時(shí)間越長，待測(cè)組分在柱子里擴(kuò)散越嚴(yán)重，越容易影響分析結(jié)果，而且人力及試劑損耗等成本也越高。

通過比較三張色譜圖1、2、3及表1、2、3可知：甲醇在流動(dòng)相比例的較小變化都會(huì)使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時(shí)間發(fā)生明顯的改變。增加甲醇在流動(dòng)相中的比例，可以使得苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時(shí)間提前；糖精鈉的保留時(shí)間變化更大，由原來的最后出峰變?yōu)樽钕瘸龇濉?/p>

圖1　色譜圖(甲醇：乙酸銨=5：95)

序號(hào)名稱保留時(shí)間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸10.9970.02.272山梨酸15.1095.42.273糖精鈉21.8416.32.36

圖2　色譜圖(甲醇：乙酸銨=10：90)

序號(hào)名稱保留時(shí)間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸8.9410.02.162山梨酸11.9434.82.173糖精鈉13.6872.42.13

圖3　色譜圖(甲醇：乙酸銨=15：85)

序號(hào)名稱保留時(shí)間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸7.5200.02.152糖精鈉9.3413.403山梨酸9.7620.70

2.3　三種組分之間的分離度

分離度的大小表示待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離程度，可以通過測(cè)定待測(cè)組分之間的分離度來對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制。分離度是兩個(gè)相鄰組分的保留值之差與其平均峰寬值之比，用R表示，當(dāng)R>0.8時(shí)，兩組分不能完全分離；當(dāng)0.8

2.4　三種組分的拖尾因子

拖尾因子反映了色譜峰的對(duì)稱性，可以用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分之間的分離效果和測(cè)量精度。一般來說拖尾因子越小，反應(yīng)出的分離效果也越好。通過比較表1、2、3可知，隨著甲醇在流動(dòng)相中的比例增加，三種組分的拖尾因子變小，峰形更尖銳。

2.5　最佳流動(dòng)相比例

綜合考慮保留時(shí)間、分離度及拖尾因子等參數(shù)，選擇甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液體積比為10：90作為試驗(yàn)方法，能實(shí)現(xiàn)苯甲酸、山梨酸和糖精鈉三種組分較好的分離效果。

2.6　精密度試驗(yàn)

按2.5選擇的試驗(yàn)方法做精密度試驗(yàn)，測(cè)定6次，其中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.12%，0.14%，0.11%，符合不大于2.0%的要求，說明試驗(yàn)方法可以得出較好的測(cè)量精度。

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The effect of adjusting the mobile phasecomponents ratio on separation

efficiency in reversed phase liquid chromatography

HUANG Qiang1LI Hua-yong1LIU Xin-guo2

(1.Ji’anMunicipalCenterforSupervisionandInspectionofQualityandTechnology，Jiangxi，Ji’an343000；

2.JiangxiProvincialProductQualitySupervisionTestingCollege，Jiangxi，Nanchang33000)

Abstract：Simultaneous determination of benzoic acid，sorbic acid and saccharin sodium by GB method，changing the mobile phase components ratio，that is，changing the polarity of mobile phase，compared the separation efficiency of three components，inspected the changing of parameter include retention time，resolution and tailing factor.The test results show that：(1)Increasing the proportion of methanol，the retention time of three components shift to an earlier time，and the maximum change of saccharin sodium；(2)Increasing the proportion of methanol can decrease the resolution and tailing factor of three components，can also meet the requirement for the resolution；(3)The comprehensive analysis of the parameters obtained in the test shows that the optimum ratio of mobile phase for the chromatographic system，and the better separation effect，the precision can also meet the requirement.

Key Words：Liquid chromatographyMobile phaseResolutionTest of system suitability