肢體缺血預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響

降低循環(huán)AngⅡ,通過中樞層面減少交感神經(jīng)活性的同時也不排除能夠降低壓力反射重調(diào)定從而進一步易化BRS。③抗動脈粥樣硬化作用。大量研究證實,四逆湯能明顯降低載脂蛋白B,增加載脂蛋白A(apoA)含量,從而減緩動脈粥樣硬化程度,使斑塊面積縮小,減輕內(nèi)膜增厚水平,且其抗動脈粥樣硬化作用與四逆湯劑量呈一定的量效依賴關(guān)系[10,11]。BRS減弱與其感受器敏感性降低有密切相關(guān)性,BRS的感受器位于頸總動脈末端和頸內(nèi)動脈起始處的膨大部分,高血壓發(fā)生頸動脈粥樣硬化的幾率很高,因此四逆湯也有可能是通過減低頸動脈粥樣硬化,增加感受器敏感性,從而達到易化BRS的作用。

參考文獻:

[1] Anversa P,Hagopian M,Loud AV.Quantitative radioautographic localization of protein syntheses in experimental cardiac hypertrophy[J].Lab Invest,1973,29(3):282 292.

[2] 劉永明,徐裕亞,王肖龍,等.益氣溫陽中藥干預(yù)對壓力負荷超載誘導(dǎo)的舒張性心力衰竭大鼠血流動力學(xué)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,26(4):7175.

[3] Capasso JM,Stroeck JE,Malhotra A,et al .Contractile behavior of rat myocardium after reversal of hypertensive hypertension [J].Am J Physiol,1982,242(5):H882 H889.

[4]Ruiz Otrega M,Ruperez M,et al .AngiotensinⅡregulates the synthesis of proinflammatory cytokines and chemokines in the kidney[J].Kidney Inter Supple,2002(82):1222.

[5] 石海蓮,張蓓蓓,劉燕,等.左前肢血壓法動態(tài)觀察腹主動脈縮窄大鼠的血壓變化[J].中國藥理學(xué)通報,2008,24(6):830 833.

[6] Smyth HS,Sleight P,Pichering GM.Reflex regulation of arterial pressure during sleep in man:A quantitative method of assessing baroreflex sensitivity[J].Cire Res,1969,24(1):109114.

[7] 劉衛(wèi),宋建華,趙志春,等.抗高血壓藥對清醒高血壓大鼠壓力感受反射敏感性的影響[J].中國藥師,1999,2(3):115.

[8] Yang M,Andresen MC.Peptidergic modulation of mechanotransduction in rat arterial baroreceptors[J].Circ Res,1990,66:804 813.

[9] Julie Wong,Unee Cand ReidI A.Role of ATI reee ptorsin the resetting of the baroreflex control of heart rateby allgiotensinⅡin the rabbit[J].Clin Invest,1993,16:1516 1520.

[10] 吳偉康,黑子清,孫惠蘭,等.四逆湯對高膽固醇喂飼所致動脈粥樣硬化形成和氧化損傷的影響[J].中國動脈硬化雜志,2003,11(6):505 508.

[11] 黃河清,吳偉康,羅漢川,等.四逆湯與維生素E抗實驗性動脈粥樣硬化的比較研究[J].中國病理生理雜志,2001,17(2):154 156.

(本文編輯郭懷印)

肢體缺血預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響

李 娜1,李光來2,張曉敏2,薛國芳2,李 滿2,馮 鵬2

摘要:目的 研究肢體缺血預(yù)處理(LIP)對腦缺血再灌注不同時間點大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響。方法 72只健康雄性SD大鼠,隨機分為假手術(shù)組24只、缺血再灌注組(MCAO組)24只、肢體缺血預(yù)處理組(LIP組)24只,MCAO組和LIP組根據(jù)再灌注時間的不同,分為3 d、7 d、14 d、21 d組,每組6只。于各相應(yīng)時間點觀察各組大鼠并進行神經(jīng)功能評分,免疫組織化學(xué)方法觀察神經(jīng)干細胞的增殖情況。結(jié)果 LIP組各時間點大鼠神經(jīng)功能評分較MCAO組減低(P<0.05);MCAO組各時間點5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)陽性細胞數(shù)均較假手術(shù)組明顯增多(P <0.05或P <0.01),LIP組各時間點BrdU陽性細胞數(shù)均顯著多于MCAO組(P<0.05),且LIP組BrdU的高峰值(14 d)較MCAO組(7 d)延長(P<0.05)。結(jié)論 反復(fù)短暫的無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)處理可以改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀,并且可激活腦缺血再灌注后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,在腦缺血再灌注損傷中具有一定的保護作用。

關(guān)鍵詞:肢體缺血預(yù)處理;腦缺血再灌注;神經(jīng)干細胞

收稿日期:(2015 01 06) (2015 01 23)

中圖分類號:R743 R255.2

文獻標(biāo)識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.12.009

文章編號:1672-1349(2015)12-1384-03

通訊作者:李光來,E mail:smuneu@163.com注損傷的問題,而由其引起的一系列復(fù)雜的繼發(fā)改變,導(dǎo)致缺血組織損傷惡化,臨床應(yīng)用有限。

作者單位:1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原030001);2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院

腦卒中是臨床上常見的急性腦血管病,其中75%為缺血性腦卒中。目前,以溶栓和腦保護作為缺血性腦卒中的主要治療策略。然而超早期溶栓治療的時間窗較短,禁忌證多,并且恢復(fù)局部血供后,會帶來再灌

腦缺血再灌注損傷是一個比較復(fù)雜的病理生理過程,而神經(jīng)元的損傷在此過程中是不可避免的。有研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)有產(chǎn)生新神經(jīng)元和修復(fù)受損區(qū)的能力,而這種能力與腦內(nèi)的神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是分不開的[1]。NSCs在體內(nèi)一般以靜息狀態(tài)存在,當(dāng)受到一定的刺激后被激活。有研究發(fā)現(xiàn),腦的缺血損害可以激活腦內(nèi)原位神經(jīng)干

細胞的增殖[2 4],但由此激活的神經(jīng)干細胞數(shù)量不足,且其中分化為神經(jīng)元的只有小部分[5,6],所以增殖的NSCs對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的修復(fù)并不完全。近年來的研究發(fā)現(xiàn)肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning,LIP)可以激活腦梗死后神經(jīng)干細胞的增殖[7],在此研究中,采用了分離股動脈之后進行反復(fù)夾閉和松開作為肢體缺血預(yù)處理的方法,此種方法有創(chuàng)且操作復(fù)雜。如果采用一種無創(chuàng)、操作簡便且安全性較高的預(yù)處理方法,將更易于被病人接受,在臨床中也能得到更好的應(yīng)用。為了證明這種方法是否可以激活腦缺血再灌注后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,本實驗采用改良的動物無創(chuàng)血壓測試儀自制套管,觀察LIP對大鼠腦缺血再灌注后海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠72只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),鼠齡3個月~4個月,體重200 g~220 g。

1.1.2 試劑與儀器 BrdU粉劑(美國Sigma公司),小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體、生物素化羊抗小鼠、SABC免疫組化染色試劑盒均購自武漢博士德有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法 72只SD大鼠,隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(MCAO組)、肢體缺血預(yù)處理組(LIP 組)。MCAO組:缺血2 h后再灌注,根據(jù)再灌注的時間不同又分為4個亞組(3 d、7 d、14 d、21 d),每組6只。LIP組:于LIP模型后立刻制備MCAO模型,根據(jù)再灌注的時間又分為4個亞組(3 d、7 d、14 d、21 d),每組6只。

1.2.2 MCAO模型的制備 參照改良Longa[8]法, 10%水合氯醛麻醉大鼠,分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA),分離并用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈(ICA),在CCA距離分岔口大約0.5 cm處剪一小口,將直徑0.235 mm的魚線插入,在剪口上方2 mm處系一活結(jié),松開動脈夾,將魚線沿CCA插入ICA內(nèi),以分岔口處開始測量距離,插入1.8 cm±0.5 cm后將之前的活結(jié)打死以固定魚線,縫合。2 h后輕輕將線栓拉出1 cm左右,形成再灌注。假手術(shù)組的魚線只插入1.0 cm,其余步驟同實驗組。

1.2.3 LIP模型的制備 將無創(chuàng)性血壓測試儀的自制套管套于大鼠左后肢根部后,加壓阻斷股動脈10 min,其阻斷標(biāo)志為脈搏消失,皮膚發(fā)紺,觸摸遠端肢體體溫下降;10 min后減壓,以恢復(fù)血流達到再灌注的目的,以脈搏出現(xiàn),皮膚潮紅,遠端肢體體溫回升為再灌注標(biāo)志,做3個循環(huán)。

1.2.4 神經(jīng)行為評分 參考Longa等的5級4分法標(biāo)準:0分,無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分,輕度局灶性神經(jīng)功能缺損,即提尾不能伸展左側(cè)前爪;2分,中度局灶性神經(jīng)功能缺損,即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,重度局灶性神經(jīng)功能缺損,即行走困難,并向左側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識水平下降。將評分為1分~3分的大鼠作為研究對象。

1.2.5 BrdU標(biāo)記方法 各組大鼠根據(jù)其再灌注相應(yīng)時間點,以50 mg/kg腹腔注射,每4 h給藥1次,共3 次,于第3次給藥后24 h取腦。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示。兩組以上總體均數(shù)的比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能評分比較(見表1)于各相應(yīng)時間點觀察各組大鼠并進行神經(jīng)功能評分,LIP組與MCAO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示LIP減輕了大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)缺損癥狀。

表1　各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分的比較(x±s)　　分

2.2 各組大鼠缺血再灌注不同時間點BrdU陽性細胞數(shù) 各組大鼠于各相應(yīng)時間點處死,取缺血側(cè)海馬組織觀察BrdU陽性細胞數(shù),BrdU陽性細胞數(shù)呈棕褐色顆粒,胞核較大、深染,呈圓形。MCAO組各時間點BrdU陽性細胞數(shù)均較假手術(shù)組明顯增多,LIP組各時間點BrdU陽性細胞數(shù)均顯著多于MCAO組;且MCAO組中BrdU陽性細胞于第7天達高峰,而LIP組的BrdU陽性細胞于缺血再灌注后第14天達高峰。

詳見表2。

表2　各組大鼠缺血側(cè)海馬BrdU陽性細胞數(shù)的比較(x±s)　　個/mm 2

3　討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn),LIP可能通過提高腦組織抗氧化酶活性[9]和誘導(dǎo)血管再生[10]等對腦缺血再灌注損傷起到一定的保護作用,且LIP能夠激活腦梗死后神經(jīng)干細胞的增殖[8]。神經(jīng)干細胞有自我更新和多向分化的潛能,來自早期胚胎階段的神經(jīng)上皮細胞。大量的研究發(fā)現(xiàn),外源性干細胞的移植[11]和不同預(yù)處理方法[12 14]對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)干細胞的增殖有促進作用,對神經(jīng)功能起到一定的保護作用[15]。但由于這些預(yù)處理方法有一定的創(chuàng)傷、操作較復(fù)雜,且不易被病人接受,而外源性干細胞的移植又存在免疫排斥反應(yīng)和需長期使用免疫抑制劑等問題,使這些措施在臨床治療工作中受到一定的局限性。因此,本實驗采用無創(chuàng)血壓測試儀自制套管做預(yù)處理方法,觀察其對隨后腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)的表達,研究無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)處理對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響,為臨床實際治療工作中提供了一種無創(chuàng)且操作簡單,病人更易接受的預(yù)處理方法。

Brdu由于其結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶核苷酸類似,在有絲分裂的S期作為底物摻入新合成的DNA鏈中,因此成為細胞增殖能力的標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示:MCAO組的BrdU陽性細胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多,LIP組的BrdU陽性細胞數(shù)較MCAO組增多,且MCAO組的BrdU陽性細胞于缺血再灌注后第7天達高峰,而LIP組的BrdU陽性細胞于第14天達高峰值。說明反復(fù)、短暫的肢體缺血預(yù)處理激活了隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注損傷大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,且延長了增殖的高峰期。而LIP組各時間點大鼠神經(jīng)功能評分較MCAO組減低,說明LIP激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,增殖的干細胞可能起到神經(jīng)功能的保護作用,從而減輕了腦缺血再灌注損傷帶來的神經(jīng)功能缺損癥狀。

綜上所述,無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)處理通過激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,在隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注損傷中起到一定的保護作用,從而為缺血性腦卒中的實際治療工作中提供了一種無創(chuàng)且操作簡單,易于被病人接受的預(yù)處理方法。

[1] 胡躍強,唐農(nóng),劉泰,等.清熱化瘀方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,9(8):977 979.

[2] 張波,王任直,李桂林.成年大鼠腦梗死后自體神經(jīng)干細胞的原位增殖[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2003,23(6):616 619.

[3] Tonchev AB,Yamashima T,Sawamoto K,et al .Enhanced proliferation of progenitor cells in the subventricular zone and limited neuronal production in the striatum and neocortex of adultmacaque monkeys after global cerebral ischemia[J].J Neurosci Res,2005,81(6):776 788.

[4] Zhang P,Liu Y,Li J,et al .Cell proliferation in ependymal/subventricular zone and nNOs expression following focal cerebral ischemia in adult rats[J].Neurol Res,2006,28(1):9196.

[5] Craig CG,Tropepe V,Morshead CM,et al.In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell population in the adult mouse brain[J].J Neurosci,1996,16(8): 2649 2658.

[6] Tan XS.Wang SH.Endogenous neural stem cells and ischemic brain injury[J].Int J Pathol Clin Med,2007,27(3):214 217.

[7] 張永輝,汪永新,劉輝,等.肢體缺血預(yù)處理對腦梗死后大鼠海馬神經(jīng)干細胞激活增殖的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009(5): 592.

[8] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al . Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20:8491.

[9] 張曉敏,李光來.肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2013,11(2):200 203.

[10] 文雅惠,李光來,薛國芳.肢體缺血預(yù)處理對腦缺血大鼠再灌注損傷VEGF、PDGF B的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2013,11(6):721 723.

[11] 馮鵬,李光來,王飛.骨髓間充質(zhì)干細胞上清液治療大鼠腦缺血的作用機制[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(3):292 294.

[12] Schitine C,Xapelli S,Agasse F,et al .Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures[J].Eur J Neurosci,2012,35(11):1672 1683.

[13] Feng Z,Liu J,Ju R.Hyperbaric oxygen treatment promotes neural stem cell proliferation in the subventricular zone of neonatal rats with hypoxicischemic brain damage [J]. Neural Regen Res,2013,8(13):1220 1227.

[14] Kitagawa K.Brain protection against cerebral ischemia[J].Rinsho Shinkeigaku,2013,53(11):1169 1171.

[15] 譚軍,孫兆印.腺苷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的影響[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(9):2527.

(本文編輯郭懷印)

·綜述與進展·