真空回流提取-高效液相色譜法測(cè)定燈盞花中的槲皮素

張燕菊,許志剛,劉智敏,田世杰，張仙麗

(昆明理工大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650500)

真空回流提取-高效液相色譜法測(cè)定燈盞花中的槲皮素

張燕菊,許志剛*,劉智敏,田世杰，張仙麗

(昆明理工大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650500)

摘要：云南具有豐富的植物和藥物資源，其主要成分的有效提取成為高效利用的關(guān)鍵．本文作者采用真空回流法提取燈盞花中的槲皮素黃酮化合物，優(yōu)化了提取條件，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定，并與常壓回流提取法進(jìn)行了對(duì)照; 結(jié)合提取后樣品的掃描電鏡分析，探討了不同提取方法對(duì)提取產(chǎn)物表觀結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果表明，真空聯(lián)用提取法優(yōu)于常壓提取法，利用真空負(fù)壓下的提取可避免黃酮化合物的氧化，提高提取效率．

關(guān)鍵詞：燈盞花；槲皮素；真空回流提取；高效液相色譜法

黃酮類化合物是植物界分布最廣的一類化合物，它集中分布于被子植物中，常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在．黃酮具有明顯的抗氧化作用和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用，具有抗衰老、抗疲勞、抗過(guò)敏、抗菌抑菌、抗炎、抗癌、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫功能等功效，在醫(yī)療和保健方面有重要而廣泛的應(yīng)用[1]．槲皮素是重要的黃酮化合物之一，在槐花、槐米、桑葉、銀杏葉、柴胡、魚(yú)腥草、葡萄籽、人字草、金銀花、車前草、槲樹(shù)皮、杠板歸、山楂等藥材中均含有較多的槲皮素．

中草藥有效成分的高效提取是植物資源充分利用的重要因素．傳統(tǒng)的中草藥提取方法有水煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法、溶劑提取法、水蒸汽蒸餾法等.這些方法存在提取效率不高，雜質(zhì)較多，提取液容易霉變，且加熱過(guò)程易于破壞熱敏性有效成分等缺點(diǎn)．在中草藥現(xiàn)代化的進(jìn)程中，逐步涌現(xiàn)出了一些新穎的提取方法和技術(shù)，如超聲提取[2-3]、微波提取[4]、超臨界流體萃取[5-6]、真空技術(shù)[7]、低溫技術(shù)[8]等．對(duì)于一些熱敏性有效成分，提取過(guò)程中需要防止被氧化和高溫分解，因而對(duì)提取技術(shù)提出了更高的要求．真空技術(shù)常用于中草藥提取后的濃縮環(huán)節(jié)，快速分離溶劑的同時(shí)保護(hù)了熱敏性化合物.近年來(lái)真空技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于中草藥的提取過(guò)程．在真空或負(fù)壓的狀態(tài)下，溶劑的沸點(diǎn)降低，可加快提取溶質(zhì)的溶出，同時(shí)避免易氧化物質(zhì)的氧化和熱敏性化合物的分解．陳曉東[7]設(shè)計(jì)了用于中藥提取的減壓提取裝置，不僅縮短了提取時(shí)間，提高了提取率，還有效的降低了能耗．XIAO等[9-11]設(shè)計(jì)了真空微波萃取裝置用于中草藥中易氧化和熱敏性化合物的提?。未悍嫉萚12]也設(shè)計(jì)了真空微波萃取裝置用于竹葉中黃酮的提?。壳?，真空技術(shù)在中草藥有效成分提取中的應(yīng)用報(bào)道并不多，而真空提取相對(duì)于常壓高溫提取已經(jīng)顯示出優(yōu)越性，它尤其適用于提取化學(xué)穩(wěn)定性差的成分．將真空技術(shù)與溶劑回流聯(lián)用，對(duì)中草藥中熱敏性和易氧化成分的提取十分有利，不僅提取效率高、操作簡(jiǎn)便，還具有廣泛的實(shí)用性．本文作者采用真空回流技術(shù)提取了云南特色中草藥燈盞花中的槲皮素黃酮，并聯(lián)用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定．

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

儀器：戴安公司高效液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000)，C18色譜柱(J&K Scientific LTD，5 μm，4.6 mm ×250 mm)，荷蘭Philip掃描電鏡(XL30 ESEM-TMP)．

試劑：燈盞花樣品從昆明市菊花村中藥市場(chǎng)購(gòu)買，并經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館鑒定；槲皮素標(biāo)樣購(gòu)于陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司(98%)；乙腈為色譜級(jí)，購(gòu)于西隴化工股份有限公司；其余化學(xué)試劑為分析純．

1.2　真空溶劑回流提取裝置

采用50 mL的圓底燒瓶為提取瓶，水浴加熱控制溫度，上端連接冷凝回流管，頂端連接玻璃三通，通過(guò)真空水泵抽真空．隨著水浴加熱至回流狀態(tài)，真空度穩(wěn)定在0.07~0.08 MPa.旋轉(zhuǎn)三通，關(guān)閉真空抽氣泵.待裝置氣壓穩(wěn)定，可進(jìn)行真空回流提?。崛〗Y(jié)束后，先旋轉(zhuǎn)三通，回復(fù)至常壓．

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

用電子天平準(zhǔn)確稱取1.00 g燈盞花粉末，置于50 mL圓底燒瓶中，加入一定量不同濃度的乙醇溶液，分別采取非真空溶劑回流提取和真空溶劑回流提取，對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間和固液比進(jìn)行優(yōu)化．得到的2個(gè)提取液經(jīng)抽濾后收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，在3 000 r/min下高速離心，用乙酸乙酯萃取離心液兩次，再將乙酸乙酯相轉(zhuǎn)入50 mL 的圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干后用提取液定容至10 mL，待測(cè)，于進(jìn)樣前過(guò)濾(0.45 μm濾膜)．

1.4　色譜分析方法

流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液(體積比為30∶70)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣為20 μL．采用峰面積進(jìn)行定量，繪制峰面積對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=-0.26+0.86X，線性范圍為0.5~10.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5．

2結(jié)果與討論

2.1　槲皮素的提取工藝條件研究

2.1.1提取溶劑

采用15.0 mL的乙醇-水溶液作為提取劑，在沸水浴中提取60 min，提取劑中乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別選取為50%、60%、70%、80%和90%.提取后抽濾，濾渣再次提取，濾液合并.濾液在50 ℃下減壓濃縮，濃縮液于3 000 r/min離心分離10 min，用15 mL的乙酸乙酯萃取濃縮液兩次.將乙酸乙酯相轉(zhuǎn)入50 mL的圓底燒瓶中，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用相應(yīng)的乙醇提取液定容至10.00 mL，然后進(jìn)行HPLC分析，并計(jì)算出樣品中的槲皮素的質(zhì)量．色譜分析結(jié)果如圖1所示，可以看出，提取液濃度為70%時(shí)的提取效果最優(yōu)；繼續(xù)增加乙醇的濃度槲皮素難以溶出，提取率反而有所降低．因此，選擇70%的乙醇溶液作為提取溶劑．

2.1.2提取時(shí)間

稱取燈盞花樣品1.00 g，以70%的乙醇水溶液為提取液，回流提取的時(shí)間分別設(shè)定為30、45、60、75和90 min，測(cè)定結(jié)果如圖2所示．可以看出，隨著提取時(shí)間的增加提取率逐步提高，但提取時(shí)間超過(guò)60 min以后提取效率略有降低．這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的沸水浴加熱，導(dǎo)致提取出來(lái)的黃酮產(chǎn)物受熱分解，因此選擇提取時(shí)間為60 min．

圖1　乙醇濃度對(duì)燈盞花中槲皮素化合物的提取影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction amount of quercetin in Erigeron Breviscapus

圖2　提取時(shí)間對(duì)槲皮素提取的影響Fig.2　Effect of extraction time on extraction amount of quercetin

2.1.3提取固液比

當(dāng)樣品質(zhì)量為1.00 g，提取劑的體積分別為10、15、20、25和30 mL，考察了固液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)對(duì)提取的影響．結(jié)果表明(圖3)，當(dāng)固液比為1∶15、1∶20、1∶25和1∶30時(shí)提取率都比較高，且1∶15提取效果最好，而固液比為1∶10時(shí)樣品溶脹后浸沒(méi)不充分，提取率較低，因此固液比選擇1∶15．

2.2　提取樣品中槲皮素的含量

采用優(yōu)化的真空回流提取法對(duì)燈盞花樣品中的槲皮素進(jìn)行提取和高效液相色譜測(cè)定，并與常壓下溶劑回流提取的方法進(jìn)行對(duì)照(圖4)．分析結(jié)果表明，真空溶劑回流提取聯(lián)用高效液相色譜法測(cè)定燈盞花樣品中的槲皮素，其萃取量可達(dá)0.068 4 mg/g(RSD=1.6%，n=5)；而非真空溶劑回流提取的萃取量?jī)H為0.048 7 mg/g (RSD=5.7%，n=5)[13]，可見(jiàn)真空回流提取法的提取率高于非真空溶劑回流的提取率.這可能與提取過(guò)程中真空無(wú)氧環(huán)境有關(guān)，避免了槲皮素黃酮化合物的高溫氧化；此外，真空負(fù)壓條件下的提取有利于促進(jìn)樣品中分析物的溶出．

圖3　固液比對(duì)槲皮素提取的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of quercetin

(a)1 mg/L 槲皮素標(biāo)樣；(b)真空回流提?。?c)常壓回流提取.圖4　燈盞花提取液的色譜圖分析圖Fig.4　Chromatograms of of Erigeron Breviscapus extraction solution

2.3　樣品提取前后的掃描電鏡圖

在1 000倍的放大倍數(shù)下，分別對(duì)真空回流提取(圖5a)、常壓回流提取(圖5b)和未經(jīng)萃取的燈盞花樣品(圖5c)進(jìn)行了掃描電鏡分析．相比于未經(jīng)處理的樣品，真空溶劑提取與非真空溶劑提取后的樣品的表面結(jié)構(gòu)都遭到明顯破壞，并形成較多孔洞和坑洼；真空條件下提取的樣品相比于常壓下提取的樣品，樣品組織表面有更加明顯的塌陷．這種變化有利于萃取溶劑的進(jìn)入，溶解并釋放細(xì)胞內(nèi)的提取物質(zhì)，從而進(jìn)一步提高提取率[14]．

(a)真空溶劑回流萃取后的樣品；(b)常壓下溶劑提取過(guò)的樣品；(c)萃取前的樣品.圖5　燈盞花樣品萃取前后的掃描電鏡對(duì)比圖Fig.5　Scanning electron micrographs of Erigeron Breviscapus samples before and after extraction

3結(jié)論

建立了真空回流提取-高效液相色譜法測(cè)定燈盞花中槲皮素黃酮化合物的分析方法．真空溶劑回流的提取率為0.068 4 mg/g，而非真空溶劑回流的提取率僅為0.048 7 mg/g，可見(jiàn)真空回流提取法具有明顯的優(yōu)勢(shì)．燈盞花樣品提取前后的掃描電鏡圖進(jìn)一步證實(shí)，相比于常壓下提取的樣品，真空條件下提取的樣品表面有更加明顯的塌陷和破壞，說(shuō)明真空環(huán)境能促進(jìn)樣品的溶蝕，有利于萃取溶劑的進(jìn)入和提取物的溶出．此外，真空條件還能避免黃酮化合物在高溫下的氧化，從而獲得更高的提取效率．

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[責(zé)任編輯：毛立群]

Determination of quercetin inErigeronBreviscapusby reflux

extraction under vacuum coupled with high performance

liquid chromatograph

ZHANG Yanju,XU Zhigang*,LIU Zhimin,TIAN Shijie,ZHANG Xianli

(FacultyofScience,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,Yunnan,China)

Abstract:Yunnan has abundant resources of plants and herbs,and the efficient applications of those plants and herbs naturally highly depend on the efficient extraction of the main components.Thus a vacuum reflux route was established to extract quercetion flavonoid from Erigeron Breviscapus.The extraction conditions were optimized.The extracted products were determined by high-performance liquid chromatograph (HPLC),while the extraction efficiency of the present route was compared with that of conventional atmosphere solvent reflux method.Moreover,the effects of different extraction methods on the appearance of the extracted products were investigated based on scanning electron microscopic observations.It was found that the vacuum extraction method is superior over atmosphere solvent reflux method,which is because the reflux extraction under vacuum favors to prevent flavonoids from oxidation and increase the extraction efficiency as well.

Keywords:Erigeron Breviscapus; quercetin; reflux extraction under vacuum; high performance liquid chromatograph

作者簡(jiǎn)介：張燕菊(1991-),女,本科生,從事色譜分析.*通訊聯(lián)系人,E-mail：chemxuzg@kmust.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21205054)，昆明理工大學(xué)分析測(cè)試基金項(xiàng)目(20140956，20140597).

收稿日期：2014-09-04.

中圖分類號(hào)：O 657.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1011(2015)02-0158-04