養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼模型大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)的影響

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養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼模型大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)的影響

李點(diǎn)1，王超群2，廖亮英1，胡平2，彭銀艷2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

〔摘要〕目的研究養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼模型大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）表達(dá)的影響。方法將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組（正常組、假手術(shù)組、養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組、新淚然組、模型組），每組12只。除正常組與假手術(shù)組外均采用去勢(shì)法制造干眼模型。造模成功后一周開(kāi)始分別給藥治療。用藥3個(gè)月后，分別進(jìn)行淚液分泌試驗(yàn)（SIT）及淚膜破裂時(shí)間（BUT）的檢測(cè)，取大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞，采用免疫組化法檢測(cè)p38MAPK的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)ICAM-1、p-p38MAPK的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組SIT明顯增多，BUT明顯延長(zhǎng)；養(yǎng)陰潤(rùn)目丸可顯著減少結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論養(yǎng)陰潤(rùn)目丸可有效改善眼表癥狀，增加淚液分泌量，延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間，下調(diào)結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)。提示干眼的發(fā)病機(jī)制與炎癥及p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼的治療具有一定的應(yīng)用前景。

〔關(guān)鍵詞〕干眼；養(yǎng)陰潤(rùn)目丸；結(jié)膜上皮細(xì)胞；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

Effects of Yangyin Runmu Pills on the Expression of ICAM-1, p38MAPK and p-p38MAPK in Conjunctival Epithelial Cells of Dry Eye Model Rats

LI Dian1, WANG Chaoqun2, LIAO Liangying1, HU Ping2, PENG Yinyan2

(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

〔Abstract〕Objective To study the effect of Yangyin Runmu Pills on the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), p38mitogen-activated Protein kinase (p38MAPK), phospho-and mitogen activated protein kinase p38antibody (pp38MAPK) in conjunctival epithelial cells of dry eye model rats. Methods Sixty Sprague -Dawley (SD) male rats were randomly divided into five groups (the normal group, sham operation group, Yangyin Runmu Pills group, Xinleiran group, model group), and 12rats in each group. All groups except for the normal group and sham operation group were prepared as the dry eye models by using the method of ovariectomy. After one week, the rats were treated with medicines. After three months treatment, schirmer tear test (STT) and tear film breakup time (BUT) of rats were detected. Theconjunctival epithelialcells were taken to test the expressive activities of p38MAPK by immunohistochemical methodand ICAM-1and p-p38MAPK by Western blot. Results Compared with the model group, SIT of Yangyin Runmu Pills group was increased obviously, BUT was extended obviously and the expressions of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cellswere decreased evidently, the differenceswere statistically significant (P<0.01). Conclusion Yangyin Runmu Pills can improve the symptoms of ocular surface, increase the tear secretion,prolong appears broken, and down -regulatethe expression of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cells, which suggests that the pathogenesis of dry eye is related with inflammation and p38MAPK signaling pathway, and Yangyin Runmu Pills have potential application fortreating dry eye.

〔Keywords〕dry eye；Yangyin Runmu Pills；conjunctival epithelial cell；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

干眼，中醫(yī)稱(chēng)為“白澀癥”，又名“干澀昏花癥”及“神水將枯癥”,是目前最常見(jiàn)的眼科疾病之一。相關(guān)研究顯示[1-2]在中國(guó)干眼發(fā)病率為17.0%，中國(guó)北部和西部地區(qū)的年齡超過(guò)60歲的女性群體干眼發(fā)病率高達(dá)31.3%和34.4%，而在東南地區(qū)發(fā)病率約為9.54%，且女性明顯高于男性。因此探索干眼發(fā)病機(jī)制及治療方法正逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。已有研究證明[3-6]，炎癥在干眼的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，且與MAPK信號(hào)通路激活相關(guān)。本課題組前期研究表明[7]，用經(jīng)驗(yàn)方養(yǎng)陰潤(rùn)目丸（原名“滋陰潤(rùn)目丸”）治療干眼，在改善患者主觀癥狀及增加淚液分泌等方面具有較好的療效，但其具體作用機(jī)制不明。因此本研究擬通過(guò)復(fù)制大鼠干眼模型，探究養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼模型大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)的影響，為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康，無(wú)眼部疾患，1月齡SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量120～150g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2011－0003。淚液分泌試驗(yàn)(schirmer I test,SIT) ≥10mm/5min和淚膜破裂時(shí)間(break-up time, BUT)≥10s的動(dòng)物方可使用。每4只1籠，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，控制室溫25℃左右，濕度55%左右。

1.1.2主要藥物養(yǎng)陰潤(rùn)目丸（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供）方藥組成：生地黃，當(dāng)歸，枸杞子，沙參，白芍等。新淚然滴眼液（Alcon Laboratories，Inc；批號(hào):219429F）主要含右旋糖酐、羥丙甲纖維素，甘油等。

1.1.3主要試劑p38（武漢博士德，BA1325－2）；ICAM（武漢博士德，A2189）；β-actin（Epitmics，1854-1）；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（碧云天，A0216）；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液（上?；鶢栴D生物，BYL40825）；BCA蛋白定量試劑盒（thermo，PICPI23223）；蛋白預(yù)染Marker（Fermentas，SM1811）；NC膜（Millipore，HATF00010）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋，SA1022）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋，AR1022）。

1.1.4主要儀器研究型正置顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；淚液檢測(cè)濾紙條（天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20120707）；mini protean 3cell電泳儀型號(hào)（BIO－RAD公司)；HI1210型號(hào)水浴鍋（Leica公司,）；暗匣（粵華醫(yī)療器械）。

1.2方法

1.2.1分組及造模SD大鼠60只（120眼），采用隨機(jī)數(shù)字法分為5組（正常組A、假手術(shù)組B、養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組C、新淚然組D、模型組E），每組12只（24眼）。參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作[8-10]，將C，D，E組大鼠切除睪丸及附睪，B組只切開(kāi)陰囊而不切除睪丸及附睪，A組不做任何處理。

1.2.2給藥方法造模后1周，待傷口基本愈合開(kāi)始給藥。C組采用生理鹽水滴眼，滴雙眼，1滴/次，3次/d，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸與生理鹽水按9g/100mL比例配置灌胃，1mL/100g，1次/d；D組采用新淚然滴眼液滴眼，滴雙眼，1滴/次，3次/d，并用生理鹽水灌胃，1mL/100g，1次/天；A、B、E組三組用生理鹽水分別灌胃與滴眼，用量及頻次同C、D組，連續(xù)給藥3個(gè)月。（根據(jù)等效劑量換算公式D2=D1×R2/R1，按60kg成人每天藥量9g，大鼠140g體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比值表》查表得R1=346.68，R2=5.55，得實(shí)驗(yàn)大鼠給藥劑量D2=9× 5.55÷346.68=0.14g，按大鼠1mL/100g灌胃，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸與生理鹽水按9g/100mL比例配置）。

1.2.3SIT試驗(yàn)及BUT測(cè)定根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠正常淚液分泌量比正常人少，以5mm×35mm大小濾紙條檢測(cè)，長(zhǎng)度僅能達(dá)到被折彎的5mm左右，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，參照文獻(xiàn)[11]，將其剪成兩半，即2.5mm×35mm大小，一端折彎5mm，置于大鼠下瞼內(nèi)1/3結(jié)膜囊處，5min后測(cè)量濾紙條浸濕長(zhǎng)度（不包括反折部分）。BUT測(cè)定：用玻璃棒蘸取1%熒光素鈉滴于大鼠下眼瞼結(jié)膜囊內(nèi)，人工瞬目后于裂隙燈下用鈷藍(lán)光掃描照射，記錄角膜第一個(gè)黑斑出現(xiàn)的時(shí)間。

1.2.4標(biāo)本取材治療3個(gè)月后，將3mm×3mm大小的乙酸纖維素薄膜紙條一角，輕輕置于大鼠顳側(cè)球結(jié)膜表面，用玻璃棒輕壓3～5min后取出，貼于5mm×5mm大小防脫氨基載玻片上，重復(fù)取標(biāo)本2次，待薄膜稍干后，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p38MAPK①涂片用蒸餾水洗2min×2次；②3%H2O2去離子水孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；③蒸餾水洗2min×2次；④PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑤滴加一抗p-p38MAPK（1∶100稀釋?zhuān)┖?7℃孵育2小時(shí)，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑥滴加相應(yīng)生物素化二抗，37℃孵育20min，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑦滴加試劑SABC，37℃孵育30min，PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑧DAB顯色：室溫條件下顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來(lái)水充分沖洗；⑨蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。

1.2.6細(xì)胞計(jì)數(shù)方法高倍鏡下每個(gè)涂片至少觀察5個(gè)視野以上，計(jì)數(shù)格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿有明顯的棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率。

1.2.7Western檢測(cè)ICAM-1、p-p38MAPK1①樣品準(zhǔn)備將組織剪成細(xì)小的碎片，按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12000r/min離心15min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱；②蛋白定量；③PAGE膠的制備；④上樣及電泳；⑤轉(zhuǎn)膜；⑥膜上蛋白的檢測(cè)；⑦膜的封閉及抗體孵育封閉：5%脫脂奶粉（檢測(cè)磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1h。一抗：根據(jù)說(shuō)明書(shū)P381∶150ICAM1∶200β-actin 1∶1000稀釋抗體,抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2h。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌5min×3次。隨后根據(jù)用量，按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌5min×3次；⑧顯色；⑨ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)詳細(xì)的數(shù)據(jù)資料，用SPPS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示。符合正態(tài)性和方差齊性時(shí),則用多因素方差分析兩兩比較法；不符合正態(tài)性和方差齊性時(shí)，則用非參多重比較法。均以P＜0.05（雙側(cè)檢驗(yàn)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SIT、BUT的測(cè)定結(jié)果

各組大鼠治療前后SIT及BUT檢測(cè)，組內(nèi)比較：A、B兩組治療前后比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；C、D、E三組用藥前后比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。組間比較：同一時(shí)間段A組與B組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；A、B兩組分別與C、D、E三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；治療前C、D、E三組之間分別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；治療3月后E組與C、D兩組分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；C組與D組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠治療前后SIT、BUT測(cè)量值比較　(±s）

表1　各組大鼠治療前后SIT、BUT測(cè)量值比較　(±s）

注：組間比較與A、B組分別比較，△△P＜0.01；與E組比較☆☆P＜0.01；治療前后比較◇P＜0.05。

A組B組C組D組E組組別n BUT(s)治療前　治療3月后12.48±1.01　12.25±1.0712.46±1.03　12.25±1.028.41±0.79△△9.61±0.82△△☆☆◇8.09±0.81△△9.12±0.69△△☆☆◇8.22±0.71△△6.21±0.72△△◇1212121212SIT（mm）治療前　治療3月后11.9±1.32　11.8±1.2711.7±1.37　11.6±1.368.0±1.07△△9.6±1.04△△☆☆◇7.8±1.15△△9.0±1.37△△☆☆◇8.0±0.98△△6.4±0.84△△

2.2各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞的p38MAPK表達(dá)的比較及病理形態(tài)學(xué)改變

去勢(shì)造模3個(gè)月后，A組和B組結(jié)膜上皮細(xì)胞呈扁平形，核居中，形圓，胞膜清晰，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)幾乎無(wú)明顯的棕黃色或棕褐色，p38MAPK蛋白表達(dá)含量極少，即無(wú)p38MAPK陽(yáng)性表達(dá)。E組結(jié)膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中有大量棕黃色沉著，即p38MAPK大量陽(yáng)性表達(dá)，其中，結(jié)膜上皮細(xì)胞部分核固縮崩解、消失，不同程度角化。C組和D組可見(jiàn)p38MAPK有表達(dá)，C組的結(jié)膜上皮細(xì)胞的棕黃色顆粒沉著程度較D組低，但兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2、圖1。

表2　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞比率　(±s）

表2　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞比率　(±s）

注：與A、B組分別比較△△P＜0.01；與E組比較☆☆P＜0.01。

組別np38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞A組B組C組D組E組12121212120.086±0.0420.124±0.0460.309±0.070△△☆☆0.354±0.066△△☆☆0.471±0.060△△

圖1　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中p38MAPK表達(dá)光鏡圖(DAB，×400)

2.3各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM -1、p -p38MAPK表達(dá)的比較

A、B組結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量少，即無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，而C、D、E組結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p-p38MAPK大量陽(yáng)性表達(dá)；C、D組結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量明顯低于E組（P＜0.01）；C、D組兩組間差異不顯著（P＞0.05），見(jiàn)表3、圖2-3。

表3　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平　(±s）

表3　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平　(±s）

注：與A、B組分別比較，△△P＜0.01；與E組比較,☆☆P＜0.01。

組別A組B組C組D組E組n 1212121212ICAM-10.129±0.0350.161±0.0480.471±0.141△△☆☆0.504±0.206△△☆☆0.875±0.412△△p-p38MAPK 0.082±0.0350.150±0.0700.361±0.113△△☆☆0.305±0.064△△☆☆0.474±0.099△△

3　討論

干眼在中醫(yī)古籍中有不同的命名，但機(jī)理基本是一致的?！秾徱暚幒穼⑵浞Q(chēng)為“神水將枯”、“白澀癥”等，而《證治準(zhǔn)繩》將其歸于干澀昏花癥?！吨T病源候論》曰：“目，肝之候也，臟腑之精華，崇脈之所聚，上液之道，其液竭者，則目澀?！蔽迮K充和，化生有源，津液在目化為神水，潤(rùn)澤目珠，濡養(yǎng)眼球。陰血虧虛，津液虧乏，則淚液生化之源不足，目失淚水濡潤(rùn)而生燥，導(dǎo)致干眼的發(fā)生?！赌拷?jīng)大成》認(rèn)為“此臟衰火作，雖真元未必遽絕，而自致之邪妄耗膏液?！敝赋龈裳凼怯筛文I虧虛，津液虧損，虛火上炎，或郁熱化火，上攻于目，灼津耗液，目失濡養(yǎng)所致。由此推測(cè)在干眼復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中，肝腎不足，津液虧虛，目失潤(rùn)養(yǎng)是其主要病機(jī)。筆者根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn),強(qiáng)調(diào)干眼與臟腑功能失調(diào)關(guān)系密切。認(rèn)為人身津液之化生，源于臟腑，滋養(yǎng)眼球，圓潤(rùn)如珠，則發(fā)揮視物察色功用，臟腑功能失調(diào)，氣血不足，氣機(jī)不暢等均引起干眼，治療應(yīng)注重整體觀念和辨證施治，堅(jiān)持以八綱辨證和臟腑辨證合參，自擬養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療干眼兼口干唇燥、頭暈眼花、腰酸腿軟、記憶力減退、舌紅苔薄少津、脈細(xì)，屬肝腎虧虛者，療效頗捷。養(yǎng)陰潤(rùn)目丸方中以生地黃、當(dāng)歸、枸杞子為君，滋補(bǔ)肝腎；沙參、白芍、石斛、桑椹子、黃精具有益胃生津、滋陰清熱、清心除煩、補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目之功效，與君藥配伍具有增水行舟之功，以緩解肝腎不足引起的干眼癥狀，共為臣藥，君臣共奏滋陰補(bǔ)腎、生津養(yǎng)血之功；佐以牡丹皮清熱涼血；菊花清熱解毒，平肝明目；黃芪益氣明目。本方以補(bǔ)為主，以清為輔，補(bǔ)清相合，補(bǔ)中有清，補(bǔ)中有散，滋補(bǔ)而不膩，清散而不過(guò)，為治療干眼癥的有效方劑。

圖2　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)

圖3　各組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)

已有研究表明[12-13]，干眼發(fā)病的共同機(jī)制是基于免疫的炎癥反應(yīng)，眾多細(xì)胞因子的交互作用參與了干眼的發(fā)病過(guò)程。各類(lèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞炎性因子的釋放，可通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信息傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、形態(tài)及功能產(chǎn)生影響。ICAM-1與干眼的損害程度呈正相關(guān)，并與T淋巴細(xì)胞滲透有關(guān)，其過(guò)度表達(dá)是由免疫反應(yīng)中的炎癥因子激活，也是眼表炎癥的標(biāo)志之一[14]。而p38MAPK被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中最重要的激酶，主要參與應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。p38MAPK的活性對(duì)正常的免疫與炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[15]，可以調(diào)控多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞表面受體的表達(dá)，如IL-l、IL-6、TNF-α等。已有研究證實(shí)[16]，p38MAPK抑制劑SB203580可明顯減少炎性因子的生成，從而減輕過(guò)度的炎性反應(yīng)。因此，通過(guò)干預(yù)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，就有可能對(duì)炎癥通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到阻斷作用，從而抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)。

通過(guò)研究觀察發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸能有效增加實(shí)驗(yàn)大鼠淚液分泌量，延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間，與模型組比較有顯著性差異，即通過(guò)去勢(shì)法造成的干眼模型是成功的。去勢(shì)造模三組分別同正常組、假手術(shù)組比較，大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均有顯著性差異，即大量陽(yáng)性表達(dá)，再次印證p38MAPK通路與干眼關(guān)系密切。用養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療的大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于模型組，且結(jié)膜上皮細(xì)胞的形態(tài)較之規(guī)則，著色程度較低，角化程度也明顯低于模型組，表明養(yǎng)陰潤(rùn)目丸能有效下調(diào)結(jié)膜上皮細(xì)胞中p38MAPK蛋白的表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)，有效維持結(jié)膜上皮細(xì)胞正常的生長(zhǎng)周期、形態(tài)及功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)養(yǎng)陰潤(rùn)目丸通過(guò)下調(diào)干眼大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白含量，從實(shí)驗(yàn)層面證明了養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療干眼的有效性，其抑制炎癥、干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的結(jié)果，均提示是養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療干眼的作用機(jī)制。

根據(jù)以上結(jié)果認(rèn)為，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸能有效治療干眼的機(jī)制可能是通過(guò)干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)，來(lái)阻斷相關(guān)炎癥反應(yīng)途徑，從而改善眼表干燥狀態(tài)。但是，ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK與p38MAPK信號(hào)通路上游或下游的相關(guān)信號(hào)分子的關(guān)系及調(diào)節(jié)機(jī)制如何有待進(jìn)一步明確。根據(jù)對(duì)各組結(jié)膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，是否有細(xì)胞凋亡等多重機(jī)制參與干眼發(fā)生發(fā)展有待進(jìn)一步分析。

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（本文編輯李杰）

〔作者簡(jiǎn)介〕李點(diǎn)，女，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向；眼表疾病的中西醫(yī)防治。

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（13JJ6063）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2015117）。

〔收稿日期〕2015-09-06

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5；R276.7

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.004