白術七物顆粒對氣陰兩虛型STC大鼠結腸組織NSE的影響

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白術七物顆粒對氣陰兩虛型STC大鼠結腸組織NSE的影響

譚蕊1，林仁敬2*，何永恒2

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208，2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005）

〔摘要〕目的研究白術七物顆粒對氣陰兩虛型結腸慢傳輸型便秘大鼠結腸組織神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）的影響，初步探討白術七物顆粒對結腸慢傳輸型便秘的作用機制。方法將60只SD大鼠按照完全隨機原則分為正常組、模型組、治療組，每組各20只。正常組予以皮下注射等體積等滲生理鹽水，模型組、治療組予以皮下注射鹽酸嗎啡注射液2.5mg/(kg·d)，共45d，并同時灌服青皮（18g）、枳殼（18g）、附子（15g）溶液，建立氣陰兩虛型結腸慢傳輸型便秘模型。造模成功后各組分別予以相應藥物進行灌胃治療，每天1次，連續(xù)14d，末次給藥后檢測各組大鼠結腸組織中NSE的含量。結果造模前,各組大鼠糞便干重比較,差異無統(tǒng)計學意義；造模后，模型組、治療組大鼠糞便干重與正常組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；造模后,模型組、治療組腸道炭末推進率與正常組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);模型組與治療組大鼠結腸組織中NSE含量明顯降低，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組與模型組相比，NSE含量相對升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論白術七物顆粒能有效治療氣陰兩虛型結腸慢傳輸型便秘，其作用與提升NSE的含量關系密切。

〔關鍵詞〕結腸慢傳輸型便秘；白術七物顆粒；氣陰兩虛型；血管活性腸肽；NSE

Effects of BaizhuQiwu Granules on the NSE in Colon Tissue of STC Rats with Deficiency of both Qi and Yin Syndrome

TAN Rui1, LIN Renjing2*, HE Yongheng2

(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China)

〔Abstract〕Objective To study the effect of Baizhu Qiwu Granules on neuron specific enolase (NSE) in colonic tissues of colon slow transit constipation rats with deficiency of both Qi and Yin syndrome and to explore its mechanism of action. Methods 60SD rats were randomly divided into normal group, model group and treatment group, 20rats in each group. The rats in normal group were given isovolumetric and isotonic normal saline in subcutaneous injections and the remaining rats in model and treatment groups were daily subcutaneous injection of 2.5mg/kg·d of morphine hydrochloride for total 45days, and at the same time administered with Qingpi (18g), Zhike (18g) and Fuzi (15g) to build thecolon slow transit constipation model rats with deficiency of both Qi and Yin syndrome.After establishing the models successfully, the rats in each group are given the corresponding drug treatment once daily for 14days. At the final injection,the level of NSE in colonic tissues of rats was measured. Results There was no significant difference in the dry weight of the feces of the rats in each group before building. After modeling, the dry weight of the feces of rats in the model group and the treatment group were significantly decreased compared with the normal group, the differences have statistical significance (P<0.01). The rate of intestinal charcoal propulsion in the model group and the treatment group were significantly decreased compared with the normal group, the differences have statistical significance (P<0.01). The content level of NSE in colon tissue of rats inthe model group and treatment group was increased compared to the normal group, the differences have statistical significance (P <0.05). The content level of NSE in colon tissue of rats in the treatment group was decreased compared to the normal group, the differences have statistical significance (P<0.05). Conclusion Baizhu Qiwu Granules can effectively treat both Qi and Yin type of colonic slow transit constipation,which may be related with the elevated NSE level.

〔Keywords〕slow transit constipation; Baizhu Qiwu Granules; deficiency of both Qi and Yin type; vasoactive intestinal peptide；NSE

結腸慢傳輸型便秘( slow transit constipation，STC)是一類主要以胃腸動力明顯減弱為特點的頑固性便秘，迄今為止其病因仍不完全明確[1]。臨床上常以便次減少、無便意、排便困難、排便不盡感為主要表現(xiàn)，癥狀頑固，治療困難。目前其發(fā)病率有呈逐年上升的趨勢，且有年輕化的趨向。本研究主要通過觀察白術七物顆粒對氣陰兩虛型STC大鼠結腸組織神經元特異性烯醇化酶的含量影響，初步探討白術七物顆粒對STC的治療作用及其作用機制，為臨床應用白術七物顆粒治療本病提供初步實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌雄各30只，體質量(210±6.5) g，均為湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心代為購買,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2011-0003。動物來源證號為：NO.43004700009363，于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級實驗室內飼養(yǎng)，室內自然光照明，溫度(22±3)℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2主要試劑及藥物白術七物顆粒劑：廣東一方制藥有限公司生產;青皮、枳殼、附子配方顆粒：廣東一方制藥有限公司生產；鹽酸嗎啡注射液10mg/支：沈陽第一制藥廠生產；神經元特異性烯醇化酶抗體:美國abcam公司生產，生產批號：09000284029。WB封閉液、Western抗體稀釋液、蛋白印跡膜再生液、兔抗大鼠一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗、Western一抗、二抗稀釋液：長沙來弗曼生物有限公司。

1.1.3器材設備電子精密天平(上海天平器械廠)；DYY-2C電泳儀(北京六一)；DYCZ-24DN垂直板電泳儀（北京六一）；VE 186轉移電泳槽（上海天能）；WD-9405B水平搖床（北京六一）；Tanon 5500全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能）；5424R臺式高速冷凍離心機（Eppendorf）；酶標儀（上海沛歐分析儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1模型的制備實驗前，將60只實驗大鼠按照完全隨機原則分為正常組、模型組、治療組，均置于實驗籠內3d，使其適應環(huán)境。模型組、治療組參照文獻[2]的方法予以皮下注射鹽酸嗎啡2.5mg/ (kg·d)，并參照文獻[3]的方法同時灌服青皮18g、枳殼18g、附子15g，加開水100mL沖泡，制成濃度為1g/mL的水溶液，每天1次，每次灌服含生藥量13g/kg體質量，隨體質量增減調整劑量。正常組皮下注射等滲等體積生理鹽水，連續(xù)45d，每天一次。觀察造模期間大鼠的一般狀況，并記錄造模前、后24h各組大鼠糞便干質量。末次造模給藥24h后，各組抽取5只大鼠分別經口灌入炭末混懸液1mL/ 100g體質量，30min后處死，立即解剖，截取直腸末端至幽門之間腸管，測量腸道全長及炭末推進距離，計算炭末推進率。

1.2.2模型成功判斷標準造模后若模型組、治療組大鼠出現(xiàn)懶動、毛色枯黃、抵抗微弱、尾巴暗、大便數(shù)量減少、顆粒變大且質硬等情況，而正常組大鼠運動靈活，飲食、飲水正常，大小便正常。且模型組與治療組大鼠糞便干重與正常組比較明顯減少，腸道炭末推進率與正常組比較明顯降低，則表明模型復制成功。

1.2.3給藥方法造模成功后，治療組大鼠按照體表面積[4]換算成成人等效劑量，即灌服白術七物顆粒水溶液，用法：加開水100mL沖泡，制成濃度為2.0g/mL的水溶液，每天1次，每次灌服含生藥量24g/kg體質量。其余兩組予以等體積等滲生理鹽水灌服，連續(xù)14d。實驗期間，每隔2天稱重1次，并根據(jù)體質量變化情況調整給藥劑量，并給予所有大鼠自由飲水攝食，每3-5天清洗實驗籠。

1.3觀察指標及方法

1.3.1一般觀察及大鼠糞便干重稱量每天觀察各組大鼠運動情況、飲食飲水情況、大便性狀改變情況并予以記錄，每天予電子精密天平稱取各組大鼠糞便干重并予以記錄。

1.3.2大鼠腸道炭末推進率測定末次造模給藥24h后，各組抽取5只大鼠分別經口灌入炭末混懸液1mL/100g體質量，30min后處死，立即解剖，截取直腸末端至幽門之間腸管，測量腸道全長及炭末推進距離，計算炭末推進距離所占腸道全長比例,即炭末推進率。

1.3.3神經元特異性烯醇化酶的含量測定在給藥14d后處死大鼠，將切取的部分結腸保存在裝有甲醛溶液的試管內待測。用Western blot法檢測神經元特異性烯醇化酶的含量。具體步驟如下：（1）組織樣本蛋白提?。喊呀M織剪切成細小碎片，按照比例加入裂解液；充分裂解后，12000轉/min離心10min，取上清。（2）培養(yǎng)細胞蛋白提取：按照6孔板每孔細胞加入裂解液，冰上裂解30min，12000轉/min離心10min，取上清。（3）SDS-PAGE電泳：電泳樣品準備，上樣前將樣品與5×SDS上樣緩沖液混勻于沸水中煮5～10min使蛋白變性；上樣，開始電泳。（4）轉膜：依據(jù)膠的大小剪取膜和6片濾紙，放入轉移緩沖液中平衡10min。放入轉移槽內，倒入電轉移緩沖液，膠放于負極面。將轉移槽置于冰浴中，插上電極，轉膜約2h。（5）封閉：把蛋白膜放置到TBST中漂洗1～2min，移至用TBST配制5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下，脫色搖床上搖動封閉1～2h。（6）抗體孵育：把濾膜放入雜交袋中，加入用TBST稀釋的一抗，4℃孵育過夜；剪開雜交袋，傾去一抗，用TBST漂洗3次，每次10min；將濾膜轉移到新的雜交袋中，加入用TBST稀釋的HRP標記二抗，室溫孵育1h；剪開雜交袋，傾去二抗，用TBST漂洗3次，每次10min。（7）顯色：ECL發(fā)光液顯色：按試劑盒說明將ECL液SolA與SolB按1:1混勻，鋪于膜上反應2min。在全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，曝光：30、60、90s，保存圖片。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“±s”表示，符合正態(tài)性，組內治療前后比較用t檢驗，多組間比較采用多元方差分析；P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1一般觀察

正常組大鼠運動靈活，飲食、飲水正常，大小便正常。模型組、治療組大鼠造模后出現(xiàn)懶動、毛色枯黃、抵抗微弱、大便數(shù)量減少、顆粒變大且質硬等情況，解剖見糞便集中在結腸段，呈串珠狀或球狀，質干硬。各組大鼠飲食飲水變化不明顯，體質量均正常增長，無明顯差異。

2.2糞便干重比較

各組大鼠糞便干重造模前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模后，模型組、治療組大鼠糞便干重與正常組比較明顯減少，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

2.3腸道炭末推進率比較

造模灌胃治療后各組隨機抽取5只大鼠進行評估，模型組、治療組與正常組比較大鼠腸道炭末推進率明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。治療組與模型組比較大鼠腸道炭末推進率相對升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表1　三組大鼠造模前與造模45d后糞便干重比較　(x±s，g)

表2　各組大鼠腸道炭末推進率比較　(±s）

表2　各組大鼠腸道炭末推進率比較　(±s）

注：與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△△P<0.01。

組　別　n　藥物劑量（g/kg）　腸道炭末推進率（%）正常組　5　-　77.19±8.00模型組　5　-　31.93±3.30**治療組　5　24　46.41±3.18**△△

2.4各組大鼠治療后結腸組織中NSE含量比較

模型組、治療組與正常組相比，NSE含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療組與模型組相比，NSE含量相對升高，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表3。

表3　各組大鼠治療后結腸組織中NSE含量水平(±s）

表3　各組大鼠治療后結腸組織中NSE含量水平(±s）

注：與正常組比較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05。

組別　n　藥物劑量（g/kg）　NSE正常組　15　-　57.14±5.49模型組　15　-　32.44±3.50*治療組　15　24　47.18±6.77*△

3　討論

STC是因結腸傳輸功能減弱致使腸內容物滯留于結腸而引起的頑固性便秘。目前臨床上通常將功能性便秘分為三類：（1）慢傳輸型便秘；（2）出口梗阻型便秘；（3）混合型便秘[5]。STC占便秘的16%-40%，約占功能性便秘的45.5%，是臨床上比較常見的一種類型。長期的慢性便秘不僅會給患者帶來許多苦惱，并且還在結腸癌、肝性腦病、乳腺疾病、早老性癡呆等病的發(fā)病中起著推波助瀾的作用。便秘甚至可以因誘發(fā)急性心梗或腦血管意外而直接危及患者生命。而目前對于STC的治療尚無特效藥，臨床上病情頑固，治療困難?，F(xiàn)代醫(yī)學采用內科治療效果常不甚滿意，手術治療有嚴格的手術適應癥且以后仍有一定的便秘復發(fā)率，并可能出現(xiàn)腹瀉等并發(fā)癥。與西醫(yī)、西藥相比，中醫(yī)藥治療STC不但在通便方面有優(yōu)勢，同時，對紊亂的胃腸功能也進行了調整，使患者的體質情況得到改善,提高了患者的生活質量，在治療便秘方面有廣闊的發(fā)展前景。

關于模型復制方面：本研究中予以皮下注射鹽酸嗎啡注射液2.5mg/(kg·d)的劑量，45d后成功復制STC大鼠模型。同時灌服青皮、枳殼、附子45d，青皮、枳殼破氣耗氣，附子大辛大熱、傷陰灼津，45d后成功復制氣陰兩虛型STC大鼠模型。此模型穩(wěn)定性較好，安全性、成功率較高。

神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）存在于哺乳動物神經組織內的成熟神經元及神經起源的細胞之中，它是糖酵解過程中烯醇化酶的一種同工酶[6]，這種酶在體內具有重要的意義，在人類神經系統(tǒng)發(fā)育之時，當神經母細胞發(fā)育而成為神經嵴時，α烯醇化酶就轉化為NSE，NSE作為神經節(jié)細胞的特異性標記物之一，它對判定神經節(jié)細胞的數(shù)量和成熟度具有很重要的意義。而且運用NSE特異抗體還可觀察神經元及神經內分泌細胞的變化。故而NSE可作為神經系統(tǒng)是否成熟的標志。

白術七物顆粒劑是何永恒教授根據(jù)北京醫(yī)院魏龍驤名老中醫(yī)的白術湯合《衛(wèi)生寶鑒》的沉香四磨湯化裁而來[7]，方中重用生白術益氣健脾，為君藥;生地黃為臣藥，生津養(yǎng)血、滋陰清熱;木香善行胃腸之氣，且能助白術使脾氣得運；檳榔尤擅行胃腸之氣，消積導滯，兼能緩瀉通便，為臣藥;沉香擅降氣溫中;烏藥擅行氣溫中；佐以升麻，升舉陽氣;諸藥合用，益氣養(yǎng)陰，降氣運下，脾滯得運，腑氣得通，便秘自除。本研究結果提示，運用白術七物顆粒治療后，結腸組織中NSE含量相對升高，證明白術七物顆粒治療STC的作用機理與升高NSE含量有密切關系。此實驗也為臨床使用白術七物顆粒治療STC提供了實驗依據(jù)。

參考文獻：

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（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*林仁敬，男，醫(yī)師，E-mail:1093025592@qq.com。

〔作者簡介〕譚蕊，男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥對肛腸疾病的防治與研究。

〔基金項目〕國家自然科學基金資助項目（81302977）。

〔收稿日期〕2015-05-19

〔中圖分類號〕R285.5；R256.35

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.003