• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    針刺對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響

    2016-01-06 01:07:10
    關(guān)鍵詞:針刺

    ?

    ·針推經(jīng)絡(luò)·

    針刺對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響

    陳文,林亞平,楊茜蕓,劉琴,肖姮,田浩梅*

    (湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,湖南長沙410208)

    〔摘要〕目的觀察針刺療法對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。方法參照ZeaLonga線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良,將40只SD大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組,治療72h后,用基因微陣列技術(shù)篩選差異表達miRNA,并對神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色檢測的梗死面積比進行比較。結(jié)果與空白組及假手術(shù)組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分,梗死面積比增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);針刺治療組相對應(yīng)指標則不同程度地降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與空白組比較,模型組有4個差異基因表達;與假手術(shù)相比,模型組有5個差異基因表達;與模型組相比,針刺組有個16差異基因表達;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論針刺療法可改善神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死面積及細胞凋亡,對腦組織起保護作用,其機制可能與針刺療法調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA有關(guān)。

    〔關(guān)鍵詞〕針刺;腦缺血再灌注損傷;miRNA

    Effects of Acupuncture on the Number of miRNA in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats

    CHEN Wen,LIN Yaping,YANG Qianyun, LIU Qin,XIAO Heng,TIAN Haomei*

    (Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

    〔Abstract〕Objective To observe the effect of acupuncture therapy on the number of miRNA in cerebral ischemia reperfusion rats. Methods Focal cerebral ischemia model was prepared with modified ZeaLonga' suture method. 40rats were randomly divided into 4groups,the blank group,the model group,the sham operation group,the acupuncture group,10in each group.After 72h treatment, the number of RNA express wasdetected with gene chip technology. The neurological function defect score and infarct size were compared. Results Compared with the blank group and sham operated group, the neurological deficit score and infarct area in the model group were significantly increased, the difference was statistically significant (P <0.05). The relative indexes of the acupuncture treatment group were decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the blank group, there were 4differential gene expressions in the model group, compared with the sham operation, the model group had 5different gene expressions. Compared with the model group, the acupuncture group had a 16difference genes expression, the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Acupuncture theapy can improve the neurological deficit, reduce the area of cerebral infarction and cell apoptosis, protect brain tissue, and its mechanism may be related to the regulation of related miRNA.

    〔Keywords〕acupuncture; cerebral ischemia reperfusion injury; miRNA

    腦缺血損傷主要有兩類,缺血的原發(fā)性損傷與再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細胞損傷,恢復(fù)血液再灌注后,其缺血性損傷反而進一步加重的現(xiàn)象,是腦血管疾病發(fā)病的主要部分,且有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。其過程包含一系列復(fù)雜的病理生理變化,機制極其復(fù)雜[1-2]。缺血期發(fā)生的病理生理變化并不是完全定型和不可逆的,血液恢復(fù)灌流后形成內(nèi)源性損傷因子,啟動一系列的病理生理過程導(dǎo)致腦缺血損傷進一步加重,即存在“缺血再灌注損傷”機制[3],這種損傷是腦血管疾病發(fā)病的主要原因。

    腦缺血再灌注損傷機制極為復(fù)雜,許多基因的表達發(fā)生明顯變化,某些蛋白的表達顯著上調(diào)[4]。近年研究認為,MicroRNA(miRNA)可能同樣參與了腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展,許多研究顯示,在腦缺血再灌注后,有許多miRNA發(fā)生了變化[5-6],而且Shup-ing Xiao[7]對腦缺血的相關(guān)miRNAs進行協(xié)同網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)各個miRNAs有不同高度的相關(guān)性。

    針刺療法治療腦缺血再灌注損傷療效確切,但具體機制仍在進一步研究,本研究觀察針刺治療CIRI大鼠72h后的腦組織miRNA的表達譜變化,探討針刺對腦缺血再灌注損傷的相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。

    1 材料與方法

    1.1動物

    SD健康雄性大鼠40只,清潔級,體質(zhì)量(265± 15)g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號SCXK(湘)2013-0004。

    1.2試劑與儀器

    10%水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(WB1001,維爾生物科技有限公司);1.5% 2,3,5-苯氯化四氮唑(TTC)溶液(C19H15,維爾生物科技有限公司);4%多聚甲醛(WB0401,維爾生物科技有限公司)。

    Shandon325型石蠟切片機(英國Shandon公司),MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)(北航公司),LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司),雙極電凝器(上海醫(yī)用激光儀器),HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海南陽儀器有限公司),腦槽、數(shù)位溫度表(TES 1310TYPE-K),大鼠肛溫溫度計(JNT)。微循環(huán)泵(Atactic Technologies公司),激光掃描儀(GenePix 4000B,Molecular Device),Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)。

    1.3動物分組及造模

    40只大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組,每組10只??瞻捉M不予造模。模型組、針刺組參照ZeaLonga[8]線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良,以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔麻醉,頸正中切口,暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA),電凝交通動脈,結(jié)扎ECA后電凝,動脈夾夾閉CCA與ICA,在頸外剪一斜形小口,將0.28mm單絲尼龍魚線頭端5mm用石蠟包被,并于18mm長度處標記,從切口處插入,栓線長度自CCA分叉處約18~20mm(根據(jù)動物體質(zhì)量而定),栓塞右側(cè)大腦中動脈,局部噴灑青霉素注射液防止感染,然后縫合皮膚,栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血2h后小心抽出栓線,即形成再灌注模型。假手術(shù)組僅插入尼龍魚線約10mm,不栓塞,其余步驟同手術(shù)組。

    1.4造模后評分標準及入組標準

    神經(jīng)功能缺損評分標準[8]:0分,無神經(jīng)功能損傷癥狀;1分,提尾時栓塞動脈對側(cè)前肢不能伸直;2分,行走時向栓塞動脈對側(cè)旋轉(zhuǎn);3分,行走時向栓塞動脈對側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。各組大鼠于缺血再灌注2h時進行神經(jīng)功能評分,剔除評分為0分和4分的大鼠,評分1-3分者入組。治療72h后各組大鼠再進行一次神經(jīng)功能評分。

    1.5干預(yù)方法

    空白組不做其它任何處理,其余各組待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定(造模后3h)以后,假手術(shù)組、模型組只捆綁不針刺;針刺組針刺相應(yīng)穴位后捻轉(zhuǎn)1min,15min后捻轉(zhuǎn)1次,留針30min,12h/次,共治療7次(療程72h)。取穴標準參照《實驗針灸學(xué)》及華興邦制定的《實驗動物圖譜》,并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。人中:唇裂鼻尖下1mm正中處。直刺1~2mm。百會:頂骨正中,平刺2mm。大椎:第7頸椎與第1胸椎間,背部正中,直刺3mm。

    1.6TTC染色測梗死面積

    治療72h后,每組隨機抽取5只大鼠,大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭取腦,用冰生理鹽水沖洗后,迅速放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍15min左右,去掉嗅球、小腦和低位腦干,冠狀切四刀,切成五片,第一刀在腦前極與視交叉連線中點處;第二刀在視交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將切片置于1.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中(37℃)避光孵育15~30min,每隔5min翻動1次。染好色后,將其置于10%甲醛中固定。

    1.7microRNA表達譜的檢測

    治療72h后,每組隨機抽取3只大鼠,微陣列實驗由LC Sciences公司進行。微陣列實驗使用4~ 8μg總RNA樣品。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3'端加上poly(A)尾巴,再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續(xù)的熒光標記。雜交反應(yīng)利用微循環(huán)泵(Atactic Technologies)的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行[9-10]。在微流體芯片上,每條檢測探針都是由一個化學(xué)修飾核苷酸編碼段[與目標microRNA互補(來源于miRBase,http://www.mirbase.org/)或是與其他RNA(質(zhì)控或是客戶定制序列)互補]和一個由聚乙二醇組成的間隔段(擴大編碼段與基質(zhì)的間距)組成。檢測探針均使用PGR(photogenerated reagent)化學(xué)法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學(xué)修飾檢測探針進行平衡。雜交使用含有25%甲酰胺的100μL 6xSSPE緩沖液[0.90M氯化鈉(NaCl),60mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4),6mM乙二胺四乙酸(EDTA),pH 6.8],雜交溫度為34℃。RNA與探針雜交后,與標記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值,然后使用LOWESS過濾[11](局部加權(quán)回歸)進行信號歸一化。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計,行正態(tài)性、方差齊性檢驗;滿足正態(tài)性、方差齊采用單因素方差分析,LSD法進行兩兩比較;方差不齊采用Tamhane T2法進行兩兩比較。不滿足正態(tài)性及方差齊者,用非參數(shù)檢驗,所有實驗數(shù)據(jù)均用“±s”表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響

    針刺組治療后比治療前神經(jīng)功能評分降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),治療后,與空白組及假手術(shù)組比較,模型組、針刺組神經(jīng)功能評分較高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與模型組比較,針刺組能降低神經(jīng)功能評分,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),如表1所示。

    表1 針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)

    表1 針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)

    注:與針刺組治療前比較葒P<0.05;與空白組比較**P<0.01;與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組相比&P<0.05。

    組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10101010再灌2h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##1.40±0.516**##治療72h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##0.80±0.422葒**##&

    2.2針刺對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響

    與空白組及假手術(shù)組比較,模型組、針刺組梗死面積比均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),即成模后各組都出現(xiàn)神經(jīng)細胞損傷;與模型組比較,針刺組梗死面積比減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。如表2所示。

    表2 針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s)

    表2 針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s)

    注:與空白組比較**P<0.01;與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較&P<0.05。

    組別n 腦梗死面積比空白組假手術(shù)組模型組針刺組55550.00±0.000.00±0.0033.43±5.64**##18.39±10.86**##&

    大鼠腦組織切片經(jīng)TTC染色后,紅色為正常腦組織,白色為梗死區(qū)域??瞻捉M和假手術(shù)組未見梗死灶,模型組可見大片白色梗死灶,證明造模成功,針刺組可見小片白色梗死灶。如圖1所示,藍色箭頭所指為梗死灶。

    圖1 各組大鼠梗死面積TTC染色圖

    2.3針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA表達譜的影響

    差異基因(miRNA)的篩選:每組選擇三個樣本按隨機方差模型進行兩組樣本間差異的篩選,利用隨機方差模型計算每個基因(miRNA)的顯著性水平(P值),按照P<0.05進行篩選,獲得差異表達的miRNA。我們在兩組之間共發(fā)現(xiàn)32個差異miRNA,與空白組相比,模型組有4個差異基因,針刺組有5個差異基因;與假手術(shù)組相比,模型組有5個差異基因,針刺組有仍7個差異基因;與模型組相比,針刺組有16個差異基因;造模后有9個基因差異表達,針刺治療后,有21個差異表達基因。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    雖然在兩組之間有眾多的差異基因(miRNA)被發(fā)現(xiàn),但并不是所有這些差異基因(miRNA)均參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。其中有些與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān),需要我們進一步驗證。

    3 討論

    miRNA是一類高度保守的長約19~25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,其種類眾多,表達具有一定的組織特異性。miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。在細胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理病理過程中,miRNAs的調(diào)節(jié)作用不容忽視。督脈屬奇經(jīng)八脈之一,是人體諸陽經(jīng)脈總匯,對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用,因此督脈與腦、脊髓等關(guān)系密切,故歷代醫(yī)家認為“病變在腦,首取督脈”。且課題前期研究表明:針刺百會、大椎、人中治療72h能改善大腦中動脈閉塞后2h再灌注模型大鼠神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積等作用,從而對腦產(chǎn)生保護作用[12],且其保護作用的實現(xiàn)為多途徑、多靶點與多條信號的調(diào)整[13]。

    近年研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后,有許多miR-NA發(fā)生了變化[5-6],我們的研究發(fā)現(xiàn),造模后,激活了9個差異表達基因,可能腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致這些基因的差異表達,也可能是這些基因表達,通過促進神經(jīng)細胞凋亡、激活某些通路、促進炎癥水腫等加重腦細胞的損傷,針刺治療后,共激活了21個差異表達基因。與造模后激活的差異基因有2個重復(fù),重復(fù)的rno-miR-331-3p、rno-let-7d-5p我們在GO基因功能中發(fā)現(xiàn),它們既能促進也能抑制細胞的凋亡,對腦缺血再灌注損傷的多方面都具有雙向調(diào)節(jié)作用,可能針刺療法能刺激以上這些miRNA,逆轉(zhuǎn)有害的影響,保護腦組織。

    表3 各組間差異基因表達(P<0.05)的數(shù)目及名稱

    也有研究認為[14],造模后miRNA 290、miRNA 494會明顯降低,針刺預(yù)處理能使其顯著提高,本實驗各組間比較中,沒有一組出現(xiàn)miRNA 290、miRNA 494,這可能與不同研究者采用的動物模型、觀察時間不同以及治療手段的不同有關(guān),可能還需要大量實驗對腦缺血損傷的治療方式、損傷變化做進一步的研究,使臨床治療更具靶向性。

    針刺治療缺血性腦損傷已被大量臨床與實驗所驗證,證明針刺對腦缺血后的神經(jīng)元具有保護作用,可以減輕腦水腫,減少梗死面積。我們驗結(jié)果顯示,造模成功后大鼠神經(jīng)功能評分增加,梗死面積明顯,針刺療法能改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損、降低腦梗死面積。其療效可能與針刺激活的21個差異基因的功能有關(guān)。本實驗只做了一個廣泛的篩選,各miRNA的功能、具體調(diào)控靶蛋白及其涉及的精準調(diào)控機制、相互之間的關(guān)聯(lián)等還需進一步研究。

    參考文獻:

    [1]Seshadri S, Beiser A, Kelly-Hayes M, et al. The lifetime risk of stroke estimates from the Framingham Study [J]. Stroke, 2006,37(2):345-350.

    [2]Rosamond W, Flegal K, Furie K, et al. American heart association statistics committee and stroke statistics subcommittee. Heart disease and stroke statistics—2008update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee [J]. Circulation,2008(117):e25-e146.

    [3]J Marc Simard, Thomas A Kent, Mingkui Chen, et al. Brain oedema in focal ischaemia:molecular pathophysiology and theoretical implications [J]. Lancet Neurology,2007,6(3):258-268.

    [4]Tischkau SA, Cohen JA, Stark JT. Time-of-day affects expression of hippocampal markers for ischemic damage induced by global ischemia [J]. Exp Neurol,2007, 208(2):314-322.

    [5]Ashuthosh D, Kellie B, Robert P. Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral MicroRNAome [J]. J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(4):675-668.

    [6]Ziu M, Fletcher L, Rana S, et al. Temporal differences in microRNA expression patterns in astrocytes and neurons after ischemic injury [J]. PLoS One,2011,6(2):e14724.

    [7]Shuping Xiao, Yingwen Ma, Haiying Zhu, et al. miRNA functional synergistic network analysis of mice with ischemic stroke [J]. Neurol Sci,2014,36(1):1590-1596.

    [8]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

    [9]Gao X, Gulari E, Zhou X. In situ synthesis of oligonucleotide microarrays [J]. Biopolymers,2004,73(5):579-596.

    [10]Zhu Q, Hong A, Sheng N, et al. Microfluidic biochip for nucleic acid and protein analysis [J]. Methods in Molecular Biology,2007(382):287-312.

    [11]Bolstad BM, Irizarry RA, Astrandand M. Speed,T.P.A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias [J]. Bioinformatics, 2003,19(2):185-193.

    [12]陳楚淘,田浩梅,張泓,等.針刺對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損及梗死面積的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,31(7): 63-66.

    [13]朱軍寶,劉步平,張泓,等.應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)篩選針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠的凋亡相關(guān)蛋白[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2014,42(3):222-225.

    [14]鄭仕平,韓為,儲浩然,等.通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)微小RNA調(diào)控機制的研究[J].針刺研究,2015, 40(2): 99-103.

    (本文編輯匡靜之)

    〔通訊作者〕*田浩梅,女,副教授,E-mail:451358104@qq.com。

    〔作者簡介〕陳文,女,在讀碩士研究生,研究方向:經(jīng)脈-臟腑相關(guān)。

    〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金青年基金項目資助(81303051);湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(201471)。

    〔收稿日期〕2015-09-24

    〔中圖分類號〕R245.3

    〔文獻標識碼〕A

    〔文章編號〕

    doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2015.11.017

    猜你喜歡
    針刺
    調(diào)神寧心針刺法治療靜脈滴注后呃逆驗案
    針刺療法治療失眠1則
    獨取“內(nèi)關(guān)”針刺臨床驗案
    以“四天穴”為主針刺治療頸源性耳鳴驗案
    談針刺“針刺之要,氣至而有效”
    治療眶上神經(jīng)痛首選針刺
    針刺治療踝部扭傷136例
    針刺聯(lián)合拔罐治療痤瘡50例
    針刺治療糖尿病前期32例
    針刺結(jié)合聰耳息鳴湯治療耳鳴80例
    欧美性猛交黑人性爽| 日韩亚洲欧美综合| 日本五十路高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久九九精品影院| 性插视频无遮挡在线免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美zozozo另类| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一本精品99久久精品77| 日本黄色视频三级网站网址| 88av欧美| 久9热在线精品视频| 观看免费一级毛片| 欧美区成人在线视频| 少妇丰满av| 欧美bdsm另类| 乱人视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产精品人妻久久久影院| 欧美在线一区亚洲| 亚洲图色成人| 在线a可以看的网站| 午夜福利欧美成人| 男女之事视频高清在线观看| 老司机福利观看| 欧美+日韩+精品| 久久久午夜欧美精品| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲四区av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| eeuss影院久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av电影不卡..在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲成人久久爱视频| 日本一本二区三区精品| 少妇高潮的动态图| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜久久久久精精品| 成人二区视频| 欧美高清性xxxxhd video| 中文字幕久久专区| 在线观看av片永久免费下载| 少妇裸体淫交视频免费看高清| aaaaa片日本免费| 真人做人爱边吃奶动态| 精品人妻1区二区| 极品教师在线免费播放| 免费看av在线观看网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩高清综合在线| 免费在线观看日本一区| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产成人a区在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久中文看片网| 日韩高清综合在线| 99热精品在线国产| 亚洲av中文av极速乱 | 天天一区二区日本电影三级| 国产私拍福利视频在线观看| 三级毛片av免费| 中文字幕av在线有码专区| 午夜免费成人在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产乱人视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲 国产 在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本黄色片子视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品一及| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产色婷婷99| 亚洲真实伦在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产69精品久久久久777片| 伦精品一区二区三区| 成人三级黄色视频| 午夜老司机福利剧场| 国产 一区 欧美 日韩| av.在线天堂| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美3d第一页| 少妇高潮的动态图| 97碰自拍视频| 99热只有精品国产| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产v大片淫在线免费观看| 国产色婷婷99| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久久久大av| 亚洲精品国产成人久久av| 毛片女人毛片| 亚洲avbb在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 午夜a级毛片| 免费看美女性在线毛片视频| 女人被狂操c到高潮| 亚洲性久久影院| 成年女人看的毛片在线观看| 久久这里只有精品中国| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲人成网站在线播| 欧美激情久久久久久爽电影| 99国产极品粉嫩在线观看| av在线天堂中文字幕| 午夜精品在线福利| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久大精品| 久久久色成人| 成人二区视频| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成人av教育| 免费观看精品视频网站| 免费观看在线日韩| 国产av在哪里看| 长腿黑丝高跟| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品福利观看| 久久久久久国产a免费观看| 久久久国产成人精品二区| 国产精品国产高清国产av| 国产精品久久久久久精品电影| 国内精品宾馆在线| 亚洲,欧美,日韩| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人毛片a级毛片在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 听说在线观看完整版免费高清| 特大巨黑吊av在线直播| 国产高潮美女av| av在线天堂中文字幕| 日本在线视频免费播放| 此物有八面人人有两片| 国模一区二区三区四区视频| 午夜日韩欧美国产| 香蕉av资源在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av免费高清在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 精品一区二区三区人妻视频| 成人av一区二区三区在线看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品国产三级普通话版| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本与韩国留学比较| 岛国在线免费视频观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲经典国产精华液单| 欧美一区二区亚洲| 99久久成人亚洲精品观看| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高清三级在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一边摸一边抽搐一进一小说| 特级一级黄色大片| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美成人a在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久亚洲精品不卡| 少妇人妻精品综合一区二区 | 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久久久黄片| 成年女人毛片免费观看观看9| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜福利18| 99riav亚洲国产免费| netflix在线观看网站| 日日撸夜夜添| 极品教师在线视频| 亚洲 国产 在线| 精品久久久久久久末码| 赤兔流量卡办理| 热99在线观看视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 欧美zozozo另类| 国产精品电影一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美3d第一页| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲七黄色美女视频| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av成人精品一区久久| .国产精品久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 精品久久久久久久久久久久久| 此物有八面人人有两片| 午夜精品久久久久久毛片777| 黄色配什么色好看| 亚洲最大成人av| 九九爱精品视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本熟妇午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产高清不卡午夜福利| 免费人成视频x8x8入口观看| av在线亚洲专区| 长腿黑丝高跟| 99热这里只有是精品50| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩一本色道免费dvd| 99riav亚洲国产免费| 搞女人的毛片| 我要看日韩黄色一级片| 看片在线看免费视频| 精品一区二区免费观看| 精品日产1卡2卡| 大型黄色视频在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av熟女| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久精品影院6| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品一区二区三区视频在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 性色avwww在线观看| 看免费成人av毛片| 日本a在线网址| av专区在线播放| www.色视频.com| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜福利在线观看吧| 人人妻人人看人人澡| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩高清综合在线| 亚洲欧美日韩东京热| 精品久久久久久久久亚洲 | 午夜影院日韩av| 真人一进一出gif抽搐免费| av天堂中文字幕网| 69av精品久久久久久| 色综合婷婷激情| 88av欧美| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩中字成人| 女人被狂操c到高潮| 成人国产一区最新在线观看| 在线免费十八禁| 国产熟女欧美一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美最新免费一区二区三区| 天天躁日日操中文字幕| h日本视频在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久久午夜电影| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久亚洲精品不卡| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日本爱情动作片www.在线观看 | 神马国产精品三级电影在线观看| 午夜激情欧美在线| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲精品成人久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩黄片免| 最近最新免费中文字幕在线| 精品福利观看| 亚洲精华国产精华精| 国内精品一区二区在线观看| 免费观看人在逋| 中文字幕av在线有码专区| 九色成人免费人妻av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 草草在线视频免费看| 老司机午夜福利在线观看视频| av中文乱码字幕在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清在线国产一区| 久久精品91蜜桃| 日日撸夜夜添| 久久久久九九精品影院| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美成人a在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日啪夜夜撸| 国产黄色小视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲18禁久久av| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| aaaaa片日本免费| 亚洲,欧美,日韩| 美女黄网站色视频| 很黄的视频免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产真实乱freesex| 12—13女人毛片做爰片一| 久久午夜亚洲精品久久| 国内精品美女久久久久久| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩黄片免| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 国产老妇女一区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产熟女欧美一区二区| 在现免费观看毛片| av在线蜜桃| 国产亚洲av嫩草精品影院| 女同久久另类99精品国产91| 春色校园在线视频观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 九九在线视频观看精品| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| a级毛片a级免费在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| av视频在线观看入口| 日韩精品中文字幕看吧| 国模一区二区三区四区视频| 国产极品精品免费视频能看的| 午夜精品在线福利| 亚洲 国产 在线| 一级黄片播放器| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美3d第一页| 成人国产麻豆网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 天堂网av新在线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 黄色丝袜av网址大全| 精品乱码久久久久久99久播| 美女被艹到高潮喷水动态| a级毛片免费高清观看在线播放| 真人做人爱边吃奶动态| 免费看美女性在线毛片视频| 白带黄色成豆腐渣| 禁无遮挡网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 22中文网久久字幕| 免费在线观看成人毛片| 日韩中字成人| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产成年人精品一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲成av人片在线播放无| 免费观看人在逋| 欧美激情久久久久久爽电影| 一本久久中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 日本 av在线| 在线播放国产精品三级| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品野战在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 简卡轻食公司| 精品久久久久久,| 亚洲人成网站在线播| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美人与善性xxx| av视频在线观看入口| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲国产精品合色在线| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲 国产 在线| 干丝袜人妻中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲第一电影网av| 波多野结衣高清作品| 国产av麻豆久久久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 免费搜索国产男女视频| 日本一本二区三区精品| 精品久久久久久久久亚洲 | 久久久久久久午夜电影| 国产精品乱码一区二三区的特点| a在线观看视频网站| 国内精品美女久久久久久| 午夜激情福利司机影院| 五月伊人婷婷丁香| 99热这里只有精品一区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| av在线亚洲专区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久精品91蜜桃| 国产中年淑女户外野战色| av国产免费在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品久久久久久久久av| 免费看光身美女| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜福利高清视频| 国产精品伦人一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 舔av片在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲四区av| 日韩一本色道免费dvd| 91麻豆av在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲无线观看免费| 日韩高清综合在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 老司机福利观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区| 中国美女看黄片| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品亚洲美女久久久| 毛片一级片免费看久久久久 | www.www免费av| 亚洲成人久久性| 一级av片app| 久久中文看片网| 亚洲午夜理论影院| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产爱豆传媒在线观看| 在线看三级毛片| 22中文网久久字幕| 午夜激情欧美在线| 嫩草影视91久久| 久99久视频精品免费| 女同久久另类99精品国产91| 欧美黑人巨大hd| 国语自产精品视频在线第100页| 最近中文字幕高清免费大全6 | 热99在线观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品国产三级普通话版| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线观看一区二区三区| 色视频www国产| 亚洲自拍偷在线| 久久草成人影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级av片app| 少妇被粗大猛烈的视频| 老司机福利观看| 亚洲美女视频黄频| 级片在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日日夜夜操网爽| 丰满乱子伦码专区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日韩亚洲欧美综合| www日本黄色视频网| 成人综合一区亚洲| 极品教师在线免费播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 精品国内亚洲2022精品成人| 69av精品久久久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 九色成人免费人妻av| 国产精品国产高清国产av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久久久亚洲 | 狠狠狠狠99中文字幕| 1000部很黄的大片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色综合站精品国产| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久国产成人免费| 久久精品国产自在天天线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费av不卡在线播放| 久久久久性生活片| 亚洲av免费在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 一本一本综合久久| 欧美bdsm另类| 中文字幕高清在线视频| www.www免费av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲国产精品久久男人天堂| 嫩草影院精品99| 免费观看在线日韩| 欧美成人免费av一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 少妇高潮的动态图| 国产中年淑女户外野战色| 国产私拍福利视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线免费十八禁| 草草在线视频免费看| 国产精品不卡视频一区二区| www.www免费av| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品久久久噜噜| 亚洲黑人精品在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 我要搜黄色片| 一区二区三区高清视频在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久精品欧美日韩精品| 国产视频一区二区在线看| 色视频www国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲经典国产精华液单| 色视频www国产| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美不卡视频在线免费观看| 成人性生交大片免费视频hd| 免费看a级黄色片| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久性生活片| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 88av欧美| 韩国av一区二区三区四区| av在线天堂中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费av毛片视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av一区综合| 99视频精品全部免费 在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩欧美精品v在线| 天堂影院成人在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 色噜噜av男人的天堂激情|