• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    針刺對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響

    2016-01-06 01:07:10
    關(guān)鍵詞:針刺

    ?

    ·針推經(jīng)絡(luò)·

    針刺對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響

    陳文,林亞平,楊茜蕓,劉琴,肖姮,田浩梅*

    (湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,湖南長沙410208)

    〔摘要〕目的觀察針刺療法對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。方法參照ZeaLonga線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良,將40只SD大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組,治療72h后,用基因微陣列技術(shù)篩選差異表達miRNA,并對神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色檢測的梗死面積比進行比較。結(jié)果與空白組及假手術(shù)組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分,梗死面積比增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);針刺治療組相對應(yīng)指標則不同程度地降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與空白組比較,模型組有4個差異基因表達;與假手術(shù)相比,模型組有5個差異基因表達;與模型組相比,針刺組有個16差異基因表達;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論針刺療法可改善神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死面積及細胞凋亡,對腦組織起保護作用,其機制可能與針刺療法調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA有關(guān)。

    〔關(guān)鍵詞〕針刺;腦缺血再灌注損傷;miRNA

    Effects of Acupuncture on the Number of miRNA in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats

    CHEN Wen,LIN Yaping,YANG Qianyun, LIU Qin,XIAO Heng,TIAN Haomei*

    (Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

    〔Abstract〕Objective To observe the effect of acupuncture therapy on the number of miRNA in cerebral ischemia reperfusion rats. Methods Focal cerebral ischemia model was prepared with modified ZeaLonga' suture method. 40rats were randomly divided into 4groups,the blank group,the model group,the sham operation group,the acupuncture group,10in each group.After 72h treatment, the number of RNA express wasdetected with gene chip technology. The neurological function defect score and infarct size were compared. Results Compared with the blank group and sham operated group, the neurological deficit score and infarct area in the model group were significantly increased, the difference was statistically significant (P <0.05). The relative indexes of the acupuncture treatment group were decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the blank group, there were 4differential gene expressions in the model group, compared with the sham operation, the model group had 5different gene expressions. Compared with the model group, the acupuncture group had a 16difference genes expression, the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Acupuncture theapy can improve the neurological deficit, reduce the area of cerebral infarction and cell apoptosis, protect brain tissue, and its mechanism may be related to the regulation of related miRNA.

    〔Keywords〕acupuncture; cerebral ischemia reperfusion injury; miRNA

    腦缺血損傷主要有兩類,缺血的原發(fā)性損傷與再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細胞損傷,恢復(fù)血液再灌注后,其缺血性損傷反而進一步加重的現(xiàn)象,是腦血管疾病發(fā)病的主要部分,且有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。其過程包含一系列復(fù)雜的病理生理變化,機制極其復(fù)雜[1-2]。缺血期發(fā)生的病理生理變化并不是完全定型和不可逆的,血液恢復(fù)灌流后形成內(nèi)源性損傷因子,啟動一系列的病理生理過程導(dǎo)致腦缺血損傷進一步加重,即存在“缺血再灌注損傷”機制[3],這種損傷是腦血管疾病發(fā)病的主要原因。

    腦缺血再灌注損傷機制極為復(fù)雜,許多基因的表達發(fā)生明顯變化,某些蛋白的表達顯著上調(diào)[4]。近年研究認為,MicroRNA(miRNA)可能同樣參與了腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展,許多研究顯示,在腦缺血再灌注后,有許多miRNA發(fā)生了變化[5-6],而且Shup-ing Xiao[7]對腦缺血的相關(guān)miRNAs進行協(xié)同網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)各個miRNAs有不同高度的相關(guān)性。

    針刺療法治療腦缺血再灌注損傷療效確切,但具體機制仍在進一步研究,本研究觀察針刺治療CIRI大鼠72h后的腦組織miRNA的表達譜變化,探討針刺對腦缺血再灌注損傷的相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。

    1 材料與方法

    1.1動物

    SD健康雄性大鼠40只,清潔級,體質(zhì)量(265± 15)g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號SCXK(湘)2013-0004。

    1.2試劑與儀器

    10%水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(WB1001,維爾生物科技有限公司);1.5% 2,3,5-苯氯化四氮唑(TTC)溶液(C19H15,維爾生物科技有限公司);4%多聚甲醛(WB0401,維爾生物科技有限公司)。

    Shandon325型石蠟切片機(英國Shandon公司),MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)(北航公司),LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司),雙極電凝器(上海醫(yī)用激光儀器),HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海南陽儀器有限公司),腦槽、數(shù)位溫度表(TES 1310TYPE-K),大鼠肛溫溫度計(JNT)。微循環(huán)泵(Atactic Technologies公司),激光掃描儀(GenePix 4000B,Molecular Device),Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)。

    1.3動物分組及造模

    40只大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組,每組10只??瞻捉M不予造模。模型組、針刺組參照ZeaLonga[8]線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良,以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔麻醉,頸正中切口,暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA),電凝交通動脈,結(jié)扎ECA后電凝,動脈夾夾閉CCA與ICA,在頸外剪一斜形小口,將0.28mm單絲尼龍魚線頭端5mm用石蠟包被,并于18mm長度處標記,從切口處插入,栓線長度自CCA分叉處約18~20mm(根據(jù)動物體質(zhì)量而定),栓塞右側(cè)大腦中動脈,局部噴灑青霉素注射液防止感染,然后縫合皮膚,栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血2h后小心抽出栓線,即形成再灌注模型。假手術(shù)組僅插入尼龍魚線約10mm,不栓塞,其余步驟同手術(shù)組。

    1.4造模后評分標準及入組標準

    神經(jīng)功能缺損評分標準[8]:0分,無神經(jīng)功能損傷癥狀;1分,提尾時栓塞動脈對側(cè)前肢不能伸直;2分,行走時向栓塞動脈對側(cè)旋轉(zhuǎn);3分,行走時向栓塞動脈對側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。各組大鼠于缺血再灌注2h時進行神經(jīng)功能評分,剔除評分為0分和4分的大鼠,評分1-3分者入組。治療72h后各組大鼠再進行一次神經(jīng)功能評分。

    1.5干預(yù)方法

    空白組不做其它任何處理,其余各組待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定(造模后3h)以后,假手術(shù)組、模型組只捆綁不針刺;針刺組針刺相應(yīng)穴位后捻轉(zhuǎn)1min,15min后捻轉(zhuǎn)1次,留針30min,12h/次,共治療7次(療程72h)。取穴標準參照《實驗針灸學(xué)》及華興邦制定的《實驗動物圖譜》,并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。人中:唇裂鼻尖下1mm正中處。直刺1~2mm。百會:頂骨正中,平刺2mm。大椎:第7頸椎與第1胸椎間,背部正中,直刺3mm。

    1.6TTC染色測梗死面積

    治療72h后,每組隨機抽取5只大鼠,大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭取腦,用冰生理鹽水沖洗后,迅速放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍15min左右,去掉嗅球、小腦和低位腦干,冠狀切四刀,切成五片,第一刀在腦前極與視交叉連線中點處;第二刀在視交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將切片置于1.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中(37℃)避光孵育15~30min,每隔5min翻動1次。染好色后,將其置于10%甲醛中固定。

    1.7microRNA表達譜的檢測

    治療72h后,每組隨機抽取3只大鼠,微陣列實驗由LC Sciences公司進行。微陣列實驗使用4~ 8μg總RNA樣品。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3'端加上poly(A)尾巴,再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續(xù)的熒光標記。雜交反應(yīng)利用微循環(huán)泵(Atactic Technologies)的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行[9-10]。在微流體芯片上,每條檢測探針都是由一個化學(xué)修飾核苷酸編碼段[與目標microRNA互補(來源于miRBase,http://www.mirbase.org/)或是與其他RNA(質(zhì)控或是客戶定制序列)互補]和一個由聚乙二醇組成的間隔段(擴大編碼段與基質(zhì)的間距)組成。檢測探針均使用PGR(photogenerated reagent)化學(xué)法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學(xué)修飾檢測探針進行平衡。雜交使用含有25%甲酰胺的100μL 6xSSPE緩沖液[0.90M氯化鈉(NaCl),60mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4),6mM乙二胺四乙酸(EDTA),pH 6.8],雜交溫度為34℃。RNA與探針雜交后,與標記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值,然后使用LOWESS過濾[11](局部加權(quán)回歸)進行信號歸一化。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計,行正態(tài)性、方差齊性檢驗;滿足正態(tài)性、方差齊采用單因素方差分析,LSD法進行兩兩比較;方差不齊采用Tamhane T2法進行兩兩比較。不滿足正態(tài)性及方差齊者,用非參數(shù)檢驗,所有實驗數(shù)據(jù)均用“±s”表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響

    針刺組治療后比治療前神經(jīng)功能評分降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),治療后,與空白組及假手術(shù)組比較,模型組、針刺組神經(jīng)功能評分較高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與模型組比較,針刺組能降低神經(jīng)功能評分,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),如表1所示。

    表1 針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)

    表1 針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)

    注:與針刺組治療前比較葒P<0.05;與空白組比較**P<0.01;與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組相比&P<0.05。

    組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10101010再灌2h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##1.40±0.516**##治療72h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##0.80±0.422葒**##&

    2.2針刺對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響

    與空白組及假手術(shù)組比較,模型組、針刺組梗死面積比均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),即成模后各組都出現(xiàn)神經(jīng)細胞損傷;與模型組比較,針刺組梗死面積比減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。如表2所示。

    表2 針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s)

    表2 針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s)

    注:與空白組比較**P<0.01;與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較&P<0.05。

    組別n 腦梗死面積比空白組假手術(shù)組模型組針刺組55550.00±0.000.00±0.0033.43±5.64**##18.39±10.86**##&

    大鼠腦組織切片經(jīng)TTC染色后,紅色為正常腦組織,白色為梗死區(qū)域??瞻捉M和假手術(shù)組未見梗死灶,模型組可見大片白色梗死灶,證明造模成功,針刺組可見小片白色梗死灶。如圖1所示,藍色箭頭所指為梗死灶。

    圖1 各組大鼠梗死面積TTC染色圖

    2.3針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA表達譜的影響

    差異基因(miRNA)的篩選:每組選擇三個樣本按隨機方差模型進行兩組樣本間差異的篩選,利用隨機方差模型計算每個基因(miRNA)的顯著性水平(P值),按照P<0.05進行篩選,獲得差異表達的miRNA。我們在兩組之間共發(fā)現(xiàn)32個差異miRNA,與空白組相比,模型組有4個差異基因,針刺組有5個差異基因;與假手術(shù)組相比,模型組有5個差異基因,針刺組有仍7個差異基因;與模型組相比,針刺組有16個差異基因;造模后有9個基因差異表達,針刺治療后,有21個差異表達基因。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    雖然在兩組之間有眾多的差異基因(miRNA)被發(fā)現(xiàn),但并不是所有這些差異基因(miRNA)均參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。其中有些與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān),需要我們進一步驗證。

    3 討論

    miRNA是一類高度保守的長約19~25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,其種類眾多,表達具有一定的組織特異性。miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。在細胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理病理過程中,miRNAs的調(diào)節(jié)作用不容忽視。督脈屬奇經(jīng)八脈之一,是人體諸陽經(jīng)脈總匯,對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用,因此督脈與腦、脊髓等關(guān)系密切,故歷代醫(yī)家認為“病變在腦,首取督脈”。且課題前期研究表明:針刺百會、大椎、人中治療72h能改善大腦中動脈閉塞后2h再灌注模型大鼠神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積等作用,從而對腦產(chǎn)生保護作用[12],且其保護作用的實現(xiàn)為多途徑、多靶點與多條信號的調(diào)整[13]。

    近年研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后,有許多miR-NA發(fā)生了變化[5-6],我們的研究發(fā)現(xiàn),造模后,激活了9個差異表達基因,可能腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致這些基因的差異表達,也可能是這些基因表達,通過促進神經(jīng)細胞凋亡、激活某些通路、促進炎癥水腫等加重腦細胞的損傷,針刺治療后,共激活了21個差異表達基因。與造模后激活的差異基因有2個重復(fù),重復(fù)的rno-miR-331-3p、rno-let-7d-5p我們在GO基因功能中發(fā)現(xiàn),它們既能促進也能抑制細胞的凋亡,對腦缺血再灌注損傷的多方面都具有雙向調(diào)節(jié)作用,可能針刺療法能刺激以上這些miRNA,逆轉(zhuǎn)有害的影響,保護腦組織。

    表3 各組間差異基因表達(P<0.05)的數(shù)目及名稱

    也有研究認為[14],造模后miRNA 290、miRNA 494會明顯降低,針刺預(yù)處理能使其顯著提高,本實驗各組間比較中,沒有一組出現(xiàn)miRNA 290、miRNA 494,這可能與不同研究者采用的動物模型、觀察時間不同以及治療手段的不同有關(guān),可能還需要大量實驗對腦缺血損傷的治療方式、損傷變化做進一步的研究,使臨床治療更具靶向性。

    針刺治療缺血性腦損傷已被大量臨床與實驗所驗證,證明針刺對腦缺血后的神經(jīng)元具有保護作用,可以減輕腦水腫,減少梗死面積。我們驗結(jié)果顯示,造模成功后大鼠神經(jīng)功能評分增加,梗死面積明顯,針刺療法能改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損、降低腦梗死面積。其療效可能與針刺激活的21個差異基因的功能有關(guān)。本實驗只做了一個廣泛的篩選,各miRNA的功能、具體調(diào)控靶蛋白及其涉及的精準調(diào)控機制、相互之間的關(guān)聯(lián)等還需進一步研究。

    參考文獻:

    [1]Seshadri S, Beiser A, Kelly-Hayes M, et al. The lifetime risk of stroke estimates from the Framingham Study [J]. Stroke, 2006,37(2):345-350.

    [2]Rosamond W, Flegal K, Furie K, et al. American heart association statistics committee and stroke statistics subcommittee. Heart disease and stroke statistics—2008update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee [J]. Circulation,2008(117):e25-e146.

    [3]J Marc Simard, Thomas A Kent, Mingkui Chen, et al. Brain oedema in focal ischaemia:molecular pathophysiology and theoretical implications [J]. Lancet Neurology,2007,6(3):258-268.

    [4]Tischkau SA, Cohen JA, Stark JT. Time-of-day affects expression of hippocampal markers for ischemic damage induced by global ischemia [J]. Exp Neurol,2007, 208(2):314-322.

    [5]Ashuthosh D, Kellie B, Robert P. Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral MicroRNAome [J]. J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(4):675-668.

    [6]Ziu M, Fletcher L, Rana S, et al. Temporal differences in microRNA expression patterns in astrocytes and neurons after ischemic injury [J]. PLoS One,2011,6(2):e14724.

    [7]Shuping Xiao, Yingwen Ma, Haiying Zhu, et al. miRNA functional synergistic network analysis of mice with ischemic stroke [J]. Neurol Sci,2014,36(1):1590-1596.

    [8]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

    [9]Gao X, Gulari E, Zhou X. In situ synthesis of oligonucleotide microarrays [J]. Biopolymers,2004,73(5):579-596.

    [10]Zhu Q, Hong A, Sheng N, et al. Microfluidic biochip for nucleic acid and protein analysis [J]. Methods in Molecular Biology,2007(382):287-312.

    [11]Bolstad BM, Irizarry RA, Astrandand M. Speed,T.P.A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias [J]. Bioinformatics, 2003,19(2):185-193.

    [12]陳楚淘,田浩梅,張泓,等.針刺對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損及梗死面積的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,31(7): 63-66.

    [13]朱軍寶,劉步平,張泓,等.應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)篩選針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠的凋亡相關(guān)蛋白[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2014,42(3):222-225.

    [14]鄭仕平,韓為,儲浩然,等.通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)微小RNA調(diào)控機制的研究[J].針刺研究,2015, 40(2): 99-103.

    (本文編輯匡靜之)

    〔通訊作者〕*田浩梅,女,副教授,E-mail:451358104@qq.com。

    〔作者簡介〕陳文,女,在讀碩士研究生,研究方向:經(jīng)脈-臟腑相關(guān)。

    〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金青年基金項目資助(81303051);湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(201471)。

    〔收稿日期〕2015-09-24

    〔中圖分類號〕R245.3

    〔文獻標識碼〕A

    〔文章編號〕

    doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2015.11.017

    猜你喜歡
    針刺
    調(diào)神寧心針刺法治療靜脈滴注后呃逆驗案
    針刺療法治療失眠1則
    獨取“內(nèi)關(guān)”針刺臨床驗案
    以“四天穴”為主針刺治療頸源性耳鳴驗案
    談針刺“針刺之要,氣至而有效”
    治療眶上神經(jīng)痛首選針刺
    針刺治療踝部扭傷136例
    針刺聯(lián)合拔罐治療痤瘡50例
    針刺治療糖尿病前期32例
    針刺結(jié)合聰耳息鳴湯治療耳鳴80例
    别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美精品高潮呻吟av久久| a级毛片黄视频| xxxhd国产人妻xxx| 国产极品天堂在线| 国产av码专区亚洲av| 两个人免费观看高清视频| av在线app专区| a级毛片黄视频| 91精品国产国语对白视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产黄色免费在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 考比视频在线观看| 一级爰片在线观看| 亚洲欧美激情在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中文字幕色久视频| 视频区图区小说| 91国产中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 免费在线观看完整版高清| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 晚上一个人看的免费电影| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 青春草视频在线免费观看| 国产免费又黄又爽又色| 丁香六月天网| 97在线人人人人妻| 久久人人爽人人片av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 十八禁网站网址无遮挡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av不卡在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产激情久久老熟女| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 男女边摸边吃奶| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品美女久久av网站| 久久狼人影院| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 韩国精品一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜激情av网站| 最近手机中文字幕大全| 水蜜桃什么品种好| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 少妇人妻久久综合中文| 日本色播在线视频| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品国产露脸久久av麻豆| 高清视频免费观看一区二区| 国产色婷婷99| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲专区中文字幕在线 | 看免费成人av毛片| 考比视频在线观看| 午夜影院在线不卡| 无遮挡黄片免费观看| 自线自在国产av| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品免费视频内射| 色婷婷久久久亚洲欧美| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久久免费视频了| 国产男人的电影天堂91| 日韩伦理黄色片| 69精品国产乱码久久久| 国产 一区精品| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲av国产av综合av卡| 1024视频免费在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美激情高清一区二区三区 | 搡老乐熟女国产| 多毛熟女@视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲最大av| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 十八禁人妻一区二区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产人伦9x9x在线观看| 成人影院久久| 久久ye,这里只有精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中国三级夫妇交换| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 精品国产一区二区久久| 亚洲国产av影院在线观看| 免费不卡黄色视频| 七月丁香在线播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品 国内视频| 两性夫妻黄色片| 99热国产这里只有精品6| 日本色播在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 大码成人一级视频| 欧美国产精品一级二级三级| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 色视频在线一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 黄色毛片三级朝国网站| 一区二区三区乱码不卡18| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 曰老女人黄片| 国产精品一二三区在线看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 97在线人人人人妻| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 热99久久久久精品小说推荐| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线观看人妻少妇| 无遮挡黄片免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品av久久久久免费| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 最近手机中文字幕大全| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品美女久久av网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品视频女| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产在视频线精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲三区欧美一区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 青春草视频在线免费观看| 蜜桃在线观看..| 国产探花极品一区二区| 黄色视频不卡| 国产成人精品在线电影| 精品免费久久久久久久清纯 | 综合色丁香网| 制服人妻中文乱码| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久韩国三级中文字幕| 精品久久久精品久久久| 色播在线永久视频| 精品国产国语对白av| 9热在线视频观看99| 下体分泌物呈黄色| 国产精品久久久久久精品古装| 久久久久久人妻| 成人午夜精彩视频在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品久久久久久电影网| 99久久综合免费| 国产片特级美女逼逼视频| 99热全是精品| 老熟女久久久| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产精品999| 夫妻性生交免费视频一级片| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 丝袜喷水一区| 97在线人人人人妻| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲成色77777| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av成人精品一二三区| 成人国语在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 丁香六月欧美| 成年版毛片免费区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av中文乱码字幕在线| 国产一卡二卡三卡精品| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产精品成人综合色| 国产色视频综合| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美成人免费av一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 精品国内亚洲2022精品成人| 咕卡用的链子| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久精品成人免费网站| 男人操女人黄网站| 国产麻豆69| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲色图综合在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 日日干狠狠操夜夜爽| 在线观看午夜福利视频| 制服诱惑二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 一级毛片精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲电影在线观看av| www.自偷自拍.com| av视频免费观看在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲全国av大片| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美激情极品国产一区二区三区| 大型av网站在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中出人妻视频一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av电影在线进入| 三级毛片av免费| 一本大道久久a久久精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产亚洲欧美精品永久| 一级毛片女人18水好多| 757午夜福利合集在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产成+人综合+亚洲专区| 乱人伦中国视频| 91精品三级在线观看| 国产成人影院久久av| 精品久久久久久成人av| 成人欧美大片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久中文看片网| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品久久电影中文字幕| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美黄色片欧美黄色片| 满18在线观看网站| 久久这里只有精品19| 看片在线看免费视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一区福利在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 九色国产91popny在线| 激情在线观看视频在线高清| 美女大奶头视频| 99国产综合亚洲精品| 制服诱惑二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品98久久久久久宅男小说| 无遮挡黄片免费观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久人妻av系列| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 国产区一区二久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 91av网站免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 男人的好看免费观看在线视频 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产av一区二区精品久久| 日本a在线网址| 一进一出抽搐动态| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 中国美女看黄片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 不卡av一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 欧美激情高清一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品中文字幕在线视频| www.999成人在线观看| 国产精华一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一本大道久久a久久精品| 亚洲自拍偷在线| 大陆偷拍与自拍| 性少妇av在线| 亚洲av片天天在线观看| 999久久久国产精品视频| 久久香蕉国产精品| 国产国语露脸激情在线看| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 久久久久国内视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品1区2区在线观看.| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美激情高清一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产成人免费无遮挡视频| 悠悠久久av| 久久久国产精品麻豆| 操美女的视频在线观看| 成人精品一区二区免费| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 真人一进一出gif抽搐免费| 国内精品久久久久精免费| 国产亚洲av高清不卡| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 99久久国产精品久久久| 日日夜夜操网爽| 国产成人欧美| 亚洲男人天堂网一区| 18美女黄网站色大片免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费无遮挡裸体视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产av精品麻豆| www国产在线视频色| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品人妻1区二区| av有码第一页| 99久久国产精品久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| www.自偷自拍.com| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品影院久久| 黑丝袜美女国产一区| 首页视频小说图片口味搜索| 美国免费a级毛片| 深夜精品福利| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美精品亚洲一区二区| 一区福利在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲第一电影网av| 亚洲三区欧美一区| 18禁国产床啪视频网站| 欧美乱妇无乱码| 国产av一区在线观看免费| 国产午夜福利久久久久久| 岛国视频午夜一区免费看| 午夜福利视频1000在线观看 | 午夜影院日韩av| 午夜亚洲福利在线播放| 中文字幕色久视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人18禁在线播放| 国产视频一区二区在线看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 电影成人av| 久久热在线av| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 99久久99久久久精品蜜桃| 美女大奶头视频| 亚洲五月天丁香| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| cao死你这个sao货| 久久影院123| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久伊人香网站| 久久久久久人人人人人| 制服丝袜大香蕉在线| 国产片内射在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 99精品久久久久人妻精品| 一本大道久久a久久精品| 在线永久观看黄色视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲在线自拍视频| 此物有八面人人有两片| 一级,二级,三级黄色视频| 身体一侧抽搐| 久久香蕉国产精品| 色av中文字幕| 身体一侧抽搐| 91av网站免费观看| 正在播放国产对白刺激| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人精品久久二区二区91| av天堂久久9| 亚洲精品一区av在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 国产午夜精品久久久久久| 成人亚洲精品av一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 天堂影院成人在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| av福利片在线| 可以在线观看毛片的网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 热re99久久国产66热| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜福利视频1000在线观看 | 国产精品九九99| 少妇的丰满在线观看| 不卡一级毛片| 欧美日韩乱码在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 韩国精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 黑人操中国人逼视频| 国产一卡二卡三卡精品| 十分钟在线观看高清视频www| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| av免费在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜久久久久精精品| 色在线成人网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 岛国在线观看网站| 99在线人妻在线中文字幕| 国产激情久久老熟女| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩大码丰满熟妇| 日韩国内少妇激情av| 91精品三级在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 嫩草影视91久久| 国产精华一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91字幕亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲自拍偷在线| 操出白浆在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| av视频在线观看入口| 久久精品国产综合久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产麻豆69| 国语自产精品视频在线第100页| 色综合亚洲欧美另类图片| 99riav亚洲国产免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩大尺度精品在线看网址 | 中国美女看黄片| 可以在线观看毛片的网站| 一级a爱片免费观看的视频| or卡值多少钱| 精品久久久久久成人av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精华一区二区三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 90打野战视频偷拍视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品久久久av美女十八| 人人妻人人澡人人看| 午夜两性在线视频| 欧美成人性av电影在线观看| 免费在线观看日本一区| 1024香蕉在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久国产欧美日韩av| 国产国语露脸激情在线看| 老汉色∧v一级毛片| 十八禁人妻一区二区| 手机成人av网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产1区2区3区精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| www.自偷自拍.com| 99精品久久久久人妻精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜亚洲福利在线播放| 两个人看的免费小视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 一区二区三区精品91| 国产亚洲精品av在线| 在线天堂中文资源库| 九色国产91popny在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 悠悠久久av| 国产精华一区二区三区| 成年版毛片免费区| 久久精品国产亚洲av高清一级| netflix在线观看网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产区一区二久久| 好男人电影高清在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 成人av一区二区三区在线看| 真人一进一出gif抽搐免费| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩av在线大香蕉| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| av有码第一页| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久国产a免费观看| av天堂在线播放| 国产精华一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日本 欧美在线| 在线观看66精品国产| 亚洲精华国产精华精| 欧美日韩精品网址| 日本 欧美在线| 精品不卡国产一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 在线av久久热| 涩涩av久久男人的天堂| 国产区一区二久久| 久久人人精品亚洲av| 成人国语在线视频| 成人三级黄色视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产看品久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲美女黄片视频| 国产成人欧美在线观看| 免费少妇av软件| 午夜福利成人在线免费观看| 日本欧美视频一区| 国产亚洲欧美精品永久| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品,欧美在线| 久久人妻av系列| 亚洲男人天堂网一区| 欧美最黄视频在线播放免费| 女性生殖器流出的白浆| 国产1区2区3区精品| or卡值多少钱| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 黑人操中国人逼视频| 日韩欧美免费精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩精品网址| 国产成人影院久久av| 色哟哟哟哟哟哟| 女警被强在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久国产乱子伦精品免费另类| 大码成人一级视频| 国产高清激情床上av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品,欧美在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 19禁男女啪啪无遮挡网站| netflix在线观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 97人妻天天添夜夜摸|