益生菌對(duì)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織及IFN-γ、IL-12表達(dá)的影響

益生菌對(duì)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織及IFN-γ、IL-12表達(dá)的影響*

**通信作者 E-mail:007yl@sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1309.066.html

王巖， 楊立**, 劉威羽

(遼寧省人民醫(yī)院 消化內(nèi)科， 遼寧 沈陽110016)

[摘要]目的： 探討益生菌VSL#3對(duì)三硝基苯磺酸鈉(TNBS)誘導(dǎo)的活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠腸道功能及干擾素(IFN)-γ、白介素12(IL-12)表達(dá)的影響。方法: 21只8周齡SD大鼠，均分為對(duì)照組(A組)、TNBS模型組(B組)及VSL#3治療組(C組)，A組給予0.25 mL生理鹽水灌腸，B、C組給予100 g/L TNBS 0.25 mL灌腸建立UC大鼠模型；造模第2天A、B組給予生理鹽水0.25 mL灌胃，C組給予VSL#3溶液0.25 mL灌胃；第8天時(shí)處死大鼠，比較各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)、病理學(xué)評(píng)分、疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分、髓過氧化物酶(MPO)活性變化和IFN-γ、IL-12免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果： A組腸組織未見潰瘍病灶，B組腸組織可見潰瘍，充血水腫程度較重，與B組比較，C組較B組潰瘍減少、縮小、并有修復(fù)；光鏡下A組無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，B組可見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下急性小血管炎癥出血和纖維素樣壞死，而C組較B組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；DAI、病理學(xué)評(píng)分C組較B組均明顯下降(P<0.01)，MPO活性低于B組而高于A組(P<0.05)；B組IFN-γ和IL-12明顯高于A組，C組較B組有降低，但仍明顯高于A組(P<0.05)；UC模型大鼠腸組織IFN-γ與IL-12的IOD值呈顯著正相關(guān)(r=0.964 0，P<0.01)，UC模型大鼠腸組織IFN-γ、IL-12的IOD值與腸組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性及DAI呈正相關(guān)(r=0.875 0、0.881 0及0.767 1，P<0.05；r=0.837 0、0.850 8及0.713 3， P<0.05)。結(jié)論： VSL#3輔助治療對(duì)TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠有確切療效，其作用機(jī)制可能與益生菌VSL#3通過有效抑制大鼠結(jié)腸黏膜 IFN-γ、IL-12 的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]結(jié)腸炎,潰瘍性； 益生菌VSL#3； 干擾素γ； 白細(xì)胞介素12; 基因表達(dá)； 大鼠，Sprague Dawley

[基金項(xiàng)目]*遼寧省自然科學(xué)

[中圖分類號(hào)]R574.62[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

Effect of Probiotic Bacteria on Colonic Mucosa Tissue and the Expression

of IFN-γ and IL-12 in Rats with Ulcerative Colitis

WANG Yan， YANG Li， LIU Weiyu

(DepartmentofGastroenterology，People'sHospitalofLiaoningProvince，Shenyang110016,Liaoning,China)

Abstract[]Objective: To investigate the effect of probiotic VSL#3 on function and inflammatory cytokines of rats with active phase of ulcerative colitis induced by TNBS. Methods: Twenty-one adult SD rats were randomly divided into normal control group (group A)，TNBS group (group B)，VSL#3 treatment group (group C), 7 in each group. Group A received enema of 0.25 mL dose of normal saline while Group B and Group C received enema of 0.25 mL of TNBS (100 g/L concentration) to construct UC rats model. After 2 days of model-building, group A and group B received intragastric administration of 0.25 mL dose of normal saline while group C received intragastric administration of 0.25 mL dose of VSL#3 solution. At 8th day, rats were killed. Morphologic changes of colonic mucosa tissue，pathology score, MPO activity and expression of IFN-γ，IL-12 immune positive cells were compared between group A, group B and group C. Results: There was no ulcer lesion in colonic mucosa tissue in group A while there was ulcer lesion in colonic mucosa tissue in group B, and the degree of congestion and edema was severe. Compared with group B, ulcer in group C decreased, shrank and repaired itself to some extent. Under light microscope, there existed no obvious inflammatory cell infiltration in group A while in group B there was a lot of infiltration of neutrophile granulocyte and leukomonocyte, and acute inflammation of small blood vessels and fibrinoid necrosis under mucous membrane. Compared with group B, in group C inflammatory cell infiltration decreased, pathology score decreased significantly (P<0.01), MPO activity decreased but higher than that of group A (P<0.05). IFN-γ and IL-12 expression levels in group B were significantly higher than those of group A while in group C these indexes decreased but still higher than those of group A. There were statistical significance in the differences between group A and group B, between group B and group C, and between group A and group C (P<0.05). The IOD value of IFN-γ in UC model rats were positively correlated with IOD value of IL-12 (r=0.964 0，P<0.01). The IOD value of IFN-γ and IOD value of IL-12 in UC model rats were positively correlated with pathology score, MPO activity and DAI(r=0.875 0,0.881 0 and 0.767 1，P<0.05；r=0.837 0,0.850 8 and 0.713 3，P<0.05). Conclusion: VSL#3 has adjuvant treatment effects in rats induced by TNBS, whose mechanism may be related to its inhibition of expression of IFN-γand IL-12 in rat colonic mucosa.

[Key words]colitis, ulcerative; probiotics VSL#3; interferon-γ; interleukin-12; gene expression; rats, Sprague-Dawley

人類腸道內(nèi)細(xì)菌影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)功能，可誘發(fā)遺傳易感個(gè)體腸道發(fā)生免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的發(fā)生。隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高和人群飲食習(xí)慣的改變，UC的發(fā)病率不斷上升。研究提示，UC的發(fā)生與免疫、遺傳和環(huán)境等多種因素相互作用有關(guān)，其中免疫功能異常、腸道菌群紊亂及遺傳敏感性因子是主要因素[1]。腸道菌群紊亂是誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎的重要原因之一，益生菌的補(bǔ)充在臨床治療中顯得尤為重要。本研究觀察益生菌VSL#3對(duì)三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)模型UC大鼠的療效，通過檢測(cè)炎性因子干擾素(Interferon)-γ和白介素(Interleukin)-12的表達(dá)變化，為應(yīng)用益生菌治療UC提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　動(dòng)物、試劑及儀器

8周齡左右SD(Sprague Dawley,SD)雄性大鼠21只，體質(zhì)量180～220 g，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。VSL#3由美國(guó)Ferring Pharmaceuticals公司生產(chǎn)，凍干活性混合益生菌，每袋2.5 g(含4 500億細(xì)菌)，TNBS(Sigma公司，濃度5%，W/V)，IFN-γ、IL-12抗體(美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司)，髓過氧化物酶(MPO，南京建成生物工程研究所)。

1.2　方法

1.2.1UC大鼠造模建立21只8周齡SD大鼠，均分為對(duì)照組(A組)、TNBS模型組(B組)及VSL#3治療組(C組)。B、C組按照參考文獻(xiàn)[2]建立TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠模型，大鼠先禁食24 h，并排空大便，乙醚麻醉大鼠后，將25 mg TNBS溶解于0.25 mL的50%乙醇中，用直徑2 mm的無菌聚乙烯管插入大鼠肛門內(nèi)約8 cm處進(jìn)行灌腸，保持肛門高位30 s，A組則給予0.25 mL灌腸生理鹽水灌腸，大鼠清醒后正常喂養(yǎng)。造模第2天開始A、B組大鼠給予生理鹽水0.25 mL灌胃，C組給予VSL#3(含120 mg VSL#3)溶液0.25 mL灌胃，連續(xù) 7 d。

1.2.2標(biāo)本采集及處理第8天時(shí)，3組實(shí)驗(yàn)大鼠給予水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后處死。用預(yù)冷生理鹽水將大腸洗凈，于結(jié)腸末端距離肛門1 cm處剪取0.5 cm2結(jié)腸組織，用0.4%多聚甲醛浸泡、石蠟包埋、切片，染色，并進(jìn)一步行免疫組織化學(xué)染色。其余標(biāo)本-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3結(jié)腸炎病理學(xué)評(píng)分和疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分參照文獻(xiàn)[3]方法，進(jìn)行結(jié)腸炎病理學(xué)評(píng)分。參照文獻(xiàn)[4]方法，在光鏡下觀察結(jié)腸黏膜炎癥程度、病變深度、隱窩破壞情況及病變范圍。

1.2.4結(jié)腸組織IFN-γ、IL-12表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法，取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫孵育15 min，滴加5%正常山羊血清室溫封閉15 min，傾去血清，勿洗；滴加一抗IFN-γ、IL-12(分別用PBS作1∶50稀釋)至完全覆蓋組織，4 ℃濕盒過夜；再滴加二抗(用PBS稀釋200倍的生物素化驢抗山羊Ig G)，37 ℃濕盒內(nèi)孵育30 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素，37 ℃溫育30 min，DAB顯色40 s，蘇木素復(fù)染3 min后自來水沖洗，常規(guī)脫水透明，封片。IFN-γ陽性表達(dá)細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)都有著色，以胞核為主，陽性著色細(xì)胞主要為黏膜固有層淋巴細(xì)胞，還有單核細(xì)胞，腸上皮細(xì)胞也有少量著色。IL-12陽性表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)以胞質(zhì)呈棕褐色為主，胞核也有少量著色陽性表達(dá)細(xì)胞主要有淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞也有少量表達(dá)，多集中于黏膜固有層內(nèi)，腸上皮細(xì)胞僅有少量陽性表達(dá)。免疫組化圖IOD值檢測(cè)應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件。

1.2.5MPO測(cè)定 取-70 ℃保存的結(jié)腸組織，根據(jù)組織量加入0.9% NaCl 2 mL制成組織勻漿液，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，取上清液備用。按MPO ELISA試劑盒說明操作，于450 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度(A)值。依據(jù)計(jì)算公式得到MPO值。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　病理學(xué)、DAI評(píng)分和MPO活性

肉眼觀察A組腸組織黏膜上皮完整，腺體排列整齊，未見潰瘍病灶。B組腸組織腸壁明顯壞死變薄并可見潰瘍，充血水腫程度較重。與B組比較，C組可見不同程度的炎癥消散，充血水腫程度減輕，潰瘍減少，縮小修復(fù)。光鏡下A組腸黏膜腺體規(guī)則，可見大量胞質(zhì)富含黏液的杯狀細(xì)胞，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組可見腸黏膜腺體破壞，隱窩變形，隱窩膿腫形成，杯狀細(xì)胞分泌減少，大量中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下急性小血管炎癥出血和纖維素樣壞死。而C組與B組相比，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，隱窩變形恢復(fù)和杯狀細(xì)胞分泌增多。DAI評(píng)分病理學(xué)評(píng)分及MPO活性比較，C組較B組均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組大鼠腸組織MPO活性與A組相比，含量顯著上升，C組MPO活性低于B組而高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2　IFN-γ、IL-12表達(dá)水平與UC模型大鼠相關(guān)性

IFN-γ和IL-12在A組腸組織僅見微弱的表達(dá)，而B組明顯高于A組，C組較B組有降低，但仍明顯高于A組，A、B及C組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05。見圖1、表1。UC模型大鼠腸組織IFN-γ與IL-12的IOD值呈顯著正相關(guān)(r=0.964 0，P<0.01)。

表1　TNBS 誘導(dǎo)的各組大鼠結(jié)腸組織DAI評(píng)分、

2.3　UC模型大鼠腸組織IFN-γ、IL-12的IOD值與DAI及MPO活性相關(guān)性

UC模型大鼠腸組織IFN-γ、IL-12的IOD值與腸組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性和DAI呈正相關(guān)(r=0.875 0、0.881 0及0.767 1，P<0.05；r=0.837 0、0.850 8及0.713 3，P<0.05)。

3討論

多項(xiàng)研究表明潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生態(tài)平衡被打破，厭氧菌數(shù)量明顯增加，益生菌數(shù)量顯著減少，潛在致病菌增加。普遍認(rèn)為腸道細(xì)菌在UC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可能是參與UC致病的始動(dòng)和持續(xù)因素。研究證明潰瘍性結(jié)腸炎患者存在腸道菌群失調(diào)[5-7]。已由免疫缺陷UC模型證實(shí)，在腸道無菌環(huán)境下不發(fā)生腸道炎性反應(yīng)，但在恢復(fù)正常腸道菌群狀態(tài)時(shí)則出現(xiàn)腸道炎性反應(yīng)[8]。

微生態(tài)制劑主要包括益生菌(probiotics)和益生元(prebiotics)。益生菌是指乳桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌等有益于腸道健康的細(xì)菌。益生菌可直接或間接作用于腸黏膜上皮而發(fā)揮作用，改善腸道菌群，使其恢復(fù)正常的腸道微生態(tài)平衡，同時(shí)增強(qiáng)腸黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)功能，最終起到防治UC的作用[9-10]。本文研究觀察到，與A組比較，B組大鼠結(jié)腸黏膜局部存在炎癥反應(yīng)和組織損傷。而治療用藥后第2天，B組及C組大鼠均有腹瀉，粘液膿血便，臨床表現(xiàn)相似，DAI差異不明顯。第3天起C組大鼠腹瀉略有減輕，至第4天C組大鼠的腹瀉，粘液膿血便明顯好轉(zhuǎn)，DAI顯著低于B組(P<0.05)。病理學(xué)觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，隱窩變形明顯恢復(fù)，杯狀細(xì)胞黏液增多，潰瘍縮小修復(fù)。表明VSL#3對(duì)TNBS誘導(dǎo)的UC治療有效。實(shí)驗(yàn)觀察到B組較A組結(jié)腸黏膜IFN-γ、IL-12表達(dá)顯著升高，提示IFN-γ、IL-12可能在UC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。IFN-γ和IL-12表達(dá)水平與腸道病理損害的大體形態(tài)和組織學(xué)評(píng)分指數(shù)及MPO活性呈顯著性正相關(guān)。因此，IFN-γ和IL-12表達(dá)量可反映腸組織的病理損害程度，可用于對(duì)UC病情的評(píng)估及治療效果的判斷。而C組結(jié)腸黏膜IFN-γ、IL-12蛋白表達(dá)水平呈不同程度下降，表明益生菌可以有效降低IFN-γ、IL-12的表達(dá)，并提示VSL#3治療UC的機(jī)制與降低IFN-γ、IL-12的表達(dá)有關(guān)。

A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為VSL#3治療組 圖1　IFN-γ和IL-12在各組大鼠結(jié)腸中的表達(dá) Fig.1　Expression of IFN-γand IL-12 in colon of rats

本研究提示益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在能降低UC炎癥腸段組織中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá),可能是其作用的機(jī)制之一。但益生菌制劑的治療效果還缺乏明確的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，有待于進(jìn)行多中心、大樣本、隨機(jī)、雙盲、對(duì)照的臨床試驗(yàn)。

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(2015-07-28收稿，2015-09-08修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華