山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分離、純化及鑒定

顧 欣 崔 潔 李 迪 王豐俊 王建中

山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分離、純化及鑒定

顧 欣1，2崔 潔1，2李 迪3王豐俊1王建中1

（林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京林業(yè)大學(xué)1，北京 100083）
（北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院2，北京 100083）
（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院3，石家莊 050026）

針對(duì)木本油料山杏的蛋白質(zhì)高值化利用問(wèn)題，利用蛋白酶Alcalase酶解山杏仁蛋白，以體外α－葡萄糖苷酶抑制能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選高活性α－葡萄糖苷酶抑制肽。山杏仁蛋白酶解液通過(guò)超濾、G－25葡聚糖凝膠柱、分子篩以及反相高效液相色譜的分離純化，最終篩選得到2種高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽，其抑制能力分別為6.6μg／mL和7.0μg／mL。利用質(zhì)譜和氨基酸測(cè)序儀對(duì)兩種α－葡萄糖苷酶抑制肽的分子質(zhì)量以及序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，確認(rèn)2種山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽分別為色氨酸－丙氨酸（WA）和蘇氨酸－色氨酸（TW），其α－葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值分別為23.97μmol／L和22.93μmol／L。

山杏仁多肽 α－葡萄糖苷酶抑制肽 分離 純化 鑒定

糖尿病是以持續(xù)性高血糖為基本生化特征的一種機(jī)制復(fù)雜的疾病，是一種因體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的慢性全身性疾?。?］。隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，糖尿病已成為僅次于腫瘤、心血管、腦血管疾病之后的嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一［2］。治療Ⅱ型糖尿病的藥物也有很多種，其中主要有胰島素促泌劑，雙胍類，胰島素分泌模式調(diào)節(jié)劑以及α－葡萄糖苷酶抑制劑［3］。α－葡萄糖苷酶的活性受到抑制，便能延緩α－糖苷酶將多糖分解為葡萄糖，從而減慢葡萄糖的吸收速度，起到降低餐后血糖水平的作用［4，5］。阿卡波糖這類人工合成的α－葡萄糖苷酶抑制劑在臨床上會(huì)伴隨一些副作用的發(fā)生，因此開(kāi)發(fā)更多天然的、安全的α－葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)Ⅱ 型糖尿病的治療有著重大的意義［6］。

山杏是我國(guó)著名的木本油料，也是三北防護(hù)林的主要樹(shù)種，廣布于我國(guó)12個(gè)省市區(qū)。山杏仁營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素，其蛋白質(zhì)含量、氨基酸總量、必需氨基酸總量高于一般堅(jiān)果，有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。山杏仁蛋白還具有抗腫瘤、降血壓、降血糖、降膽固醇等功效［7－9］。研究人員成功從蠶絲蛋白中提取了三肽的α－葡萄糖苷酶抑制劑［10］。研究了山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分離篩選，對(duì)所得高活性α－葡萄糖苷酶抑制肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，為II型糖尿病肽類治療劑的開(kāi)發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山杏仁：平泉亞歐杏仁有限公司；α－葡萄糖苷酶（Intestinal acetone powders from rat，10 G）、4 － 硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷（PNPG，純度＞99%）、1，1－二苯基－2－苦肼基（1，1，－dipheny1－2－picry－h(huán)ydrazy，DPPH）：Sigma 公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、鹽酸、無(wú)水乙醇：北京化工廠，均為分析純?cè)噭灰译?、三氟乙酸、甲醇均為色譜純?cè)噭罕本┌轄柕仙锛夹g(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.2 材料與儀器

微孔濾膜（水系0.45μL，有機(jī)系0.22μL）：北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限公司；高效液相層析色譜分析儀：上海滬西儀器分析廠；PPSQ－31A全自動(dòng)蛋白／多肽序列儀：日本Shimadzu Corporation；?KTA avant 25系統(tǒng)：日本；反相高效液相色譜：日本島津。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山杏仁蛋白的提?。?1］

稱取10 g脫脂山杏仁粉（過(guò)篩60目）溶于140 mL去離子水中，配制成溶液在細(xì)胞破碎儀下破碎10 min，使樣品蛋白充分溶出。維持體系溫度為37℃，pH 9.0，提取山杏仁蛋白60 min反應(yīng)結(jié)束后，將浸提液在4 000 r／min條件下離心20 min，得到上清液調(diào)pH 至4.1，并在5 000 r／min 下離心15 min，收集沉淀，水洗沉淀調(diào)節(jié)其pH值至中性，迅速冷凍干燥得到山杏仁蛋白，并且在－20℃ 下貯藏以備用。

1.2.2 山杏仁蛋白酶解物制備

選取蛋白酶Alcalase 2.4 L FG（簡(jiǎn)稱Alcalase）水解山杏仁蛋白，具體參數(shù)：料液比為50 g／L，加酶量為0.75%（體積比），pH值為9.0，水解溫度為50℃，水解時(shí)間為6 h。

1.2.3 α－葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

樣品對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制能力利用分光光度計(jì)法［12］，通過(guò)反應(yīng)生成PNP的量來(lái)確定。一定濃度的樣品中加入50μL 25 mg／mLα－葡萄糖苷酶溶液，50μL 0.913 3 mg／mL PNPG 溶液及120 μL 0.5 mol／L（pH 6.7）磷酸緩沖溶液?；靹蚝笤?7℃ 下保溫60 min，加入0.67 mol／L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。空白組用去離子水替代樣品溶液，背景組用磷酸緩沖液代替酶和底物。反應(yīng)在405 nm下測(cè)定吸光值。計(jì)算公式：

式中：B為α－葡萄糖苷酶活性抑制率；A空為空白組的吸光度值；A樣為樣品組的吸光度值；A背為背景組的吸光度值。

1.2.4 α－葡萄糖苷酶抑制肽分離純化

α－葡萄糖苷酶抑制肽分離純化基本流程：

山杏仁蛋白Alcalase水解產(chǎn)物→超濾→凝膠層析→反相高效液相色譜→分子篩→第2次反相高效液相色譜→高純度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽。

1.2.4.1 超濾

山杏仁蛋白Alcalase水解產(chǎn)物在4℃條件下經(jīng)不同分子質(zhì)量大小的超濾膜（MWCO 30 000 u、10 000 u、5 000 u）獲得具有不同分子質(zhì)量的濾液，并測(cè)定各部分濾液的體外α－葡萄糖苷酶抑制活性。

1.2.4.2 Sephadex G－25 Medium凝膠層析分離

具有高α－葡萄糖苷酶抑制活性的組分經(jīng)G－25葡聚糖凝膠色譜進(jìn)行層析分離。流動(dòng)相為：10 mmol／L Tris－HCl（pH 7.0）。色譜柱條件：Sephadex G25 Medium 柱（1.6 cm ×60 cm；Pharmacia，USA），流速為1 mL／min，整個(gè)設(shè)備系統(tǒng)在4℃ 下進(jìn)行。洗脫峰在280 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)并收集。

1.2.4.3 反相高效液相色譜分離

具有高α－葡萄糖苷酶抑制活性的組分經(jīng)反向高校液相色譜柱分離。色譜柱為Zorbax SB－C18反相高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流動(dòng)相A（0.06%三氟乙酸的水溶液）為平衡緩沖液，流動(dòng)相B（0.05%三氟乙酸的乙腈溶液）為洗脫緩沖液。分離純化的洗脫梯度為流動(dòng)相B（0%～50%）洗脫26 min，流動(dòng)相A（50%～100%）洗脫4 min，洗脫峰在280 nm處進(jìn)行檢測(cè)并收集。

1.2.4.4 分子篩分離

分離出的高活性的組分經(jīng)過(guò)?KTA avant 25系統(tǒng)分離。分子篩的柱子SuperdexTM Peptide 10／300 GL（10 mm ×300 mm）。平衡緩沖液為20 mmoL／L PBS 緩沖溶液（pH 7.0），流速0.5 mL／min，進(jìn)樣量為100μL洗脫梯度為等梯度2個(gè)柱體積，洗脫峰在280 nm處檢測(cè)并收集。

1.2.4.5 反相高效液相色譜純化

得到的高活性的山杏仁多肽凍干粉用反相高效液相色譜繼續(xù)純化，進(jìn)一步得到高純度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽。具體的色譜條件及方法與反向色譜分離的操作步驟相同。

1.2.5 α－葡萄糖苷酶抑制肽質(zhì)譜及氨基酸序列分析

分離純化后的α－糖苷酶抑制肽的分子質(zhì)量通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，其氨基酸序列通過(guò)PPSQ－31A全自動(dòng)蛋白／多肽序列儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 α－葡萄糖苷酶抑制肽分離純化

蛋白質(zhì)的水解程度與其生成肽鏈的長(zhǎng)短有一定的關(guān)系，通常可以認(rèn)為平均肽鏈長(zhǎng)度＝1／水解度［13］。短肽容易以完整的形式被吸收進(jìn)入人體代謝循環(huán)中，從而其生物活性較容易保持，本研究最終得到水解度為29.43%的山杏仁蛋白水解度，平均肽鏈長(zhǎng)度為3.4，較易被人體吸收。

蛋白酶Alcalase酶解的山杏仁蛋白酶解液經(jīng)過(guò)分子質(zhì)量截留后，得到30 ku以上，30～10 ku，10～5 ku和5 ku以下4個(gè)不同分子質(zhì)量的酶解液，分別測(cè)定其α－葡萄糖苷酶抑制活性。有研究表明蛋白水解物截留分子質(zhì)量與其生物活性有一定的關(guān)系，超濾物的分子質(zhì)量越小其抑制活性越高［14］。由圖1可知，分子質(zhì)量0～5 ku的組分α－葡萄糖苷酶抑制能力最強(qiáng)（0.42 mg／mL）。因此選取分子質(zhì)量為0～5 ku Alcalase山杏仁蛋白酶解液繼續(xù)分離質(zhì)純化。

圖1 不同分子質(zhì)量的酶解液的α－葡萄糖苷酶抑制活性

在分離純化的過(guò)程中，利用多種分離手段相結(jié)合的方式，更容易將目的產(chǎn)物分離出來(lái)［15］。因此選用Sephadex G－25 Medium凝膠柱分離蛋白酶Alcalase酶解液0～5 ku組分，得到3個(gè)主要吸收峰：P1、P2和P3，具體結(jié)果見(jiàn)圖2，分別測(cè)定其α－葡萄糖苷酶抑制活性。各色譜峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值見(jiàn)圖3，色譜峰P2對(duì)α－葡萄糖苷酶抑制抑制能力較高達(dá)到0.001 6 mg／mL，對(duì)該組分進(jìn)一步的分離篩選。

圖2 Alcalase酶解液0～5 ku組分Sephadex G－25凝膠層析色譜圖

圖3 Alcalase酶解液0～5 ku組分分離峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性

蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2組分經(jīng)反相C18柱分離得到P2P1、P2P2、P2P3、P2P4和P2P5五個(gè)主要組分（圖4），分別測(cè)定各組分的α－葡萄糖苷酶抑制活性，其中組分P2P1α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值為0.007 1 mg／mL，組分P2P2α － 葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值為0.007 5 mg／mL，與另外3個(gè)組分相比有較高的α－葡萄糖苷酶抑制活性（見(jiàn)圖5）。選用分子篩對(duì)組分P2P1、P2P2進(jìn)一步分離純化。

圖4 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2組分反相高效液相色譜圖

圖5 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2組分分離峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性

產(chǎn)物P2P1組分經(jīng)過(guò)SuperdexTM Peptide 10／300 GL柱分離得到色譜圖見(jiàn)圖6，選取最大吸收峰b用反相高效液相色譜純化高純度組分B（圖7），對(duì)B組分進(jìn)行α－葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，最終得到高純度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽B（IC50＝0.006 6 mg／mL）。

用與組分P2P1相同的分離方法來(lái)篩選蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2P2組分得到分子篩色譜圖（圖8），選取主峰d進(jìn)行純化得到高純度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽D（圖9），其α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值為0.007 0 mg／mL。所得2種α－葡萄糖苷酶抑制肽比市售降糖藥拜糖平（IC50為0.010 8 mg／mL）的α －葡萄糖苷酶抑制能力更強(qiáng)［16］。

圖6 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2P1組分分子篩色譜圖

圖7 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物b分離峰的高效液相色譜純化色譜圖

圖8 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物P2P2組分分子篩色譜圖

圖9 蛋白酶Alcalase酶解液分離產(chǎn)物d分離峰的高效液相色譜純化色譜圖

2.2 α－葡萄糖苷酶抑制肽結(jié)構(gòu)

2.2.1 α－葡萄糖苷酶抑制肽B

純化后獲得的高活性的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽B的質(zhì)譜結(jié)果如圖10所示，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為：275.4 g／mol。經(jīng)過(guò)N－端氨基酸序列分析，B的氨基酸序列為色氨酸－丙氨酸（Trp－Ala），實(shí)際分子質(zhì)量為275.31 g／mol。

2.2.2 α－葡萄糖苷酶抑制肽D

純化后獲得的高活性的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽D的質(zhì)譜結(jié)果如圖11所示，測(cè)定其分子質(zhì)量為306.3 u。經(jīng)過(guò)N－端氨基酸序列分析，D的氨基酸序列為蘇氨酸－色氨酸（Thr－Trp），實(shí)際分子質(zhì)量為305.34 u。

圖10 蛋白酶Alcalase酶解肽（B）質(zhì)譜分析圖

圖11 蛋白酶Alcalase酶解肽（D）質(zhì)譜分析圖

3 結(jié)論

利用酶解、分子質(zhì)量截留、分子篩、反相高效液相色譜等技術(shù)，對(duì)山杏仁蛋白酶解液進(jìn)行分離純化，得到兩種α－葡萄糖苷酶抑制肽，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析和氨基酸序列分析，最終得到的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽分別為色氨酸－丙氨酸（WA）和蘇氨酸－色氨酸（TW），兩者的α－葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值分別為23.97 μmol／L 和22.93 μmol／L，其α－葡萄糖苷酶抑制能力優(yōu)于市售藥物拜糖平。這不僅為血糖的控制提供了一個(gè)良好的植物蛋白來(lái)源，而且提高了山杏仁蛋白在產(chǎn)業(yè)中的利用價(jià)值。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的多肽可以利用合成的方法提高其產(chǎn)量，應(yīng)用于如降糖的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者其他生物活性的研究。

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Separation，Purification，and Identification ofα － Glucosidase Inhibitory Peptides from Apricot Kernel Proteins

Gu Xin1，2Cui Jie1，2Li Di3Wang Fengjun1Wang Jianzhong1
（Beijing Key Laboratory of Forest Processing and Safety Beijing Forestry University1，Beijing 100083）
（School of Natural Preservation Area，Beijing Forestry University2，Beijing 100083）
（Hebei Chemical＆ Pharmaceutical College3，Shijiazhuang 050026）

Apricot kernel proteins was hydrolyzed by Alcalase to solve the problem of high－value utilization of woody oil apricot kernel，using in vitroα －glucosidase inhibiting ability as the evaluation index to screen high－activityα－glucosidase peptide inhibitors.Two kinds of high－activityα－glucosidase peptide inhibitors were isolated and purified from apricot kernel protein hydrolyzates via ultrafiltration，Sephadex G －25，molecular sieve，and reversed phase high－performance liquid chromatography.The inhibition of the AGA inhibitory peptides was 6.6 μg／mL and 7.0 μg／mL，respectively.The molecular structure and sequences of the AGA inhibitory peptides were identified through mass spectrometry and amino acid sequencing.The AGA inhibitory peptides from the apricot kernel hydrolyzate were identified as WA and TW.The median inhibitory concentration of WA was 23.97 μmol／L and that of TW was 22.93 μmol／L.

apricot kernel polypeptides，AGA inhibitory peptides，separation，purification，identification

TS201.2

A

1003－0174（2016）08－0116－06

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004081）

2014－12－05

顧欣，女，1983年出生，博士，生物資源利用與天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)

王建中，男，1952年出生，教授，生物資源利用與天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)