響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助亞麻木酚素提取工藝及抗氧化性研究

李會珍 李 娜 張志軍 李曉君 陳 鐵

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助亞麻木酚素提取工藝及抗氧化性研究

李會珍 李 娜 張志軍 李曉君 陳 鐵

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

以亞麻籽為原料，對超聲波輔助提取亞麻木酚素進(jìn)行了研究。通過單因素試驗(yàn)，分別考察原料顆粒度、超聲功率、液固比、超聲溫度和超聲時間對亞麻木酚素得率的影響。并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對超聲波提取亞麻木酚素工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。研究結(jié)果表明，超聲波輔助提取亞麻木酚素的最佳工藝條件為：原料顆粒度60目，提取溶劑60%乙醇，超聲功率400 W，液固比17∶1，超聲溫度40℃，超聲時間15 min，亞麻木酚素得率為7.18 mg／g?？寡趸钚匝芯勘砻?，亞麻木酚素對DPPH、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力，IC50值分別為145 mg／L、75 mg／L 和0.25 mg／L。

亞麻籽 木酚素 超聲波 響應(yīng)面法 抗氧化性

亞麻（linum usititatissimum Linaceae），俗稱“胡麻”，屬于亞麻科亞麻屬一年生草本植物，是世界十大油料作物之一［1－2］。亞麻籽含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素及酚酸類、黃酮類等營養(yǎng)成分。由于亞麻籽富含必需脂肪酸—α－亞麻酸（LNA）和亞油酸（LA），且這兩種脂肪酸的比例比較適合人類營養(yǎng)需求，因此亞麻籽一直被認(rèn)為是人類獲取必需脂肪酸的最佳來源。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)，亞麻籽中還含有一種很具開發(fā)潛力的成分——木酚素，是存在于亞麻籽種皮中的一種生理活性物質(zhì)，一般約占籽粒質(zhì)量的0.9% ～1.5%，比其他已知含木酚素的66種食品高75～800倍［3］。亞麻木酚素又叫開環(huán)異落葉松酚二葡萄糖苷（SDG，Secoisolariciresinol Diglucoside），是與人體雌激素十分相似的植物激素，對雌激素依賴性疾病乳腺癌、前列腺癌、經(jīng)期綜合征、骨質(zhì)疏松等有較好的預(yù)防作用。除此之外，臨床研究顯示亞麻木酚素具有抗氧化性，而且對糖尿病、胃腸腫瘤、冠心病、腎臟病，抗氧化性都有有益的作用［4－7］。近年來，符合療效性要求的高純度標(biāo)準(zhǔn)化木酚素提取物產(chǎn)品也已上市，可廣泛應(yīng)用于膠囊壓片、谷物早餐和快餐食品的添加劑。而中國是亞麻生產(chǎn)大國，開發(fā)利用亞麻木酚素具有廣闊的市場前景和研究意義。

目前，亞麻木酚素的提取方法主要有溶劑萃取法［8］、亞臨界水提取［9－10］、超臨界CO2萃取法和酶法［11］等。溶劑萃取法雖然成本較低，但是耗時太長，提取率低。超臨界CO2萃取法和酶法則存在成本較高，不易推廣的缺點(diǎn)。超聲波輔助提取技術(shù)以其溶劑耗量少，省時高效的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用［3］。本試驗(yàn)以Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法，對亞麻木酚素超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為亞麻木酚素的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器

亞麻籽：中北大學(xué)生物資源化工研究所。開環(huán)異落葉松樹脂酚（SECO）標(biāo)樣：純度95%，Sigma公司。正己烷、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷鉬酸等：均為分析純，天津光復(fù)試劑廠。

UV－9600紫外可見光分光光度計(jì)：北京瑞麗分析儀器有限公司；TH－400BQG數(shù)控超聲波清洗器：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；DHG－9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海申光儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 磷鉬酸顯色法測定亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甲醇溶解SECO，配制濃度為11.65μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 標(biāo)準(zhǔn)液至20 mL試管中，各加入3倍體積5%的磷鉬酸乙醇溶液（g／mL），在80℃水浴中蒸去溶劑，將各管移入沸水浴中加熱15 min，然后流水冷卻，加入10 mL蒸餾水，振蕩至完全溶解，然后用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行波長掃描，確定最大吸收波長，在最大吸收波長下測定各處理的吸光值，以濃度對吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 亞麻木酚素提取及得率測定

將亞麻籽粉碎后過20、40、60、80、100 目篩，分別與正己烷1∶6混合脫脂10 h后，3 000 r／min離心20 min，脫脂粉末于40℃下熱風(fēng)干燥。準(zhǔn)確稱取脫脂亞麻籽粉3 g放入三角瓶中，按一定的固液比加入60%的乙醇溶液封口，設(shè)置一定的超聲功率、超聲溫度和超聲時間，每隔5 min震蕩1次，使其超聲均勻。超聲結(jié)束后，抽濾，測定濾出醇提液體積。量取一定量的醇提液放入試管中，加入1 mol／L的NaOH，使醇提液中NaOH濃度調(diào)至0.25 mol／L，堿解2 h。堿解結(jié)束后加入1 mol／L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0。用0.45 μm醋酸纖維素膜微濾。采用正丁醇萃取，減壓濃縮，甲醇復(fù)溶移至容量瓶中，如1.2.1操作進(jìn)行測定。亞麻木酚素得率按下面公式計(jì)算。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別考察原料顆粒度20、40、60、80、100 目；超聲功率300、350、400、450、500 W；液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1；超聲溫度30、35、40、45、50 ℃；超聲時間10、15、20、25、30 min 對亞麻木酚素得率的影響。從試驗(yàn)結(jié)果分析確定考察區(qū)間，以此作為中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

采用Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻木酚素的提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用顆粒度為60目的脫脂亞麻籽粉為原料，60%乙醇為提取溶劑，提取功率400 W，以得率為響應(yīng)值（Y），以液固比（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時間（X3）分別為自變量，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。

表1 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平表

1.2.5 抗氧化能力測定

DPPH·自由基清除能力按郭雪峰等［12］方法測定，略有改動。10 mL比色管中依次加入4.0 mL 51.3 mg／L DPPH·溶液和1.0 mL 95%乙醇，混勻反應(yīng)穩(wěn)定后，以95%乙醇液為參比，在518 nm處測吸光值，記為A0；同法依次加入95%的乙醇溶液4.0 mL和1.0 mL待測試樣溶液，測定吸光值，記為Ar；依次加入4.0 mL 51.3 mg／L DPPH·溶液和1.0 mL待測試液，測定吸光值，記為As。計(jì)算自由基清除率（Y）＝［1－（As－Ar）／A0］×100%。清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度即為半數(shù)抑制率IC50值（mg／L）。

過氧化氫（H2O2）清除能力按劉大川等［13］的方法測定。超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力按郭雪峰等［14］的方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

亞麻木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0．203 8X－0．009，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 6，表明相關(guān)度高，可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木酚素的含量。

圖1 磷鉬酸顯色法測定亞麻木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 原料顆粒度的影響

以粉碎后分別過20、40、60、80、100 目篩的亞麻籽粉為原料，在液固比15∶1，超聲溫度40℃，超聲時間20 min條件下，以產(chǎn)物得率比較不同顆粒度原料的效果（見圖2）。試驗(yàn)結(jié)果表明，原料的顆粒度大小對得率的影響較大，隨著顆粒度的減小得率先增加后減小，在60目時達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著篩子孔徑逐漸減小，雜質(zhì)逐漸被挑出，在后續(xù)工藝中能夠與有機(jī)溶劑充分混合，使提取率大大增加。但是在篩孔達(dá)到80目之后，部分亞麻籽粉也被篩孔阻隔，造成了試驗(yàn)材料的極大浪費(fèi)。綜合考慮試驗(yàn)成本，提取原料的顆粒度應(yīng)采用60目。

圖2 原料顆粒度對亞麻木酚素得率的影響

2.2.2 超聲功率的影響

以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料（下同），在液固比15∶1，超聲溫度40℃，超聲時間20 min條件下，分別以300、350、400、450、500 W 超聲功率進(jìn)行提?。ㄒ妶D3）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在功率達(dá)到400 W之前，亞麻木酚素得率隨超聲功率的增大而增大，當(dāng)超過400 W后亞麻木酚素得率逐漸下降，說明功率過大會破壞亞麻木酚素而使得率下降。綜合考慮試驗(yàn)需求，選擇400 W對亞麻木酚素進(jìn)行提取。

圖3 超聲功率對亞麻木酚素得率的影響

2.2.3 液固比的影響

超聲溫度40℃，超聲時間20 min，超聲功率400 W的條件下，液固比對亞麻木酚素得率的影響見圖4。隨著液固比的增大，提取物得率在15∶1和20∶1時達(dá)到最大值，繼續(xù)增大液固比，得率反而有所下降，這是因?yàn)楫?dāng)溶劑過量會造成超聲作用不完全，不能將所有的細(xì)胞壁震破，而導(dǎo)致木酚素得率偏低，綜合考慮生產(chǎn)成本，選擇15∶1為響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心水平因素。

圖4 液固比對亞麻木酚素得率的影響

2.2.4 提取溫度的影響

在超聲功率400 W，液固比15∶1，提取時間20 min的條件下，超聲溫度對亞麻木酚素得率的影響見圖5。結(jié)果表明，隨著超聲溫度的增加，得率先增加后減小，在40℃達(dá)到最大值，45℃后亞麻木酚素得率趨于平緩，逐漸下降。原因是溫度過高，亞麻籽粉中活性成分被破壞，而且雜質(zhì)的溶出量會增加，所以木酚素得率會下降。因此超聲溫度的考查水平值定為40℃。

圖5 提取溫度對亞麻木酚素得率的影響

2.2.5 超聲時間的影響

在超聲功率400 W，液固比15∶1，提取溫度40℃條件下，考察超聲時間對亞麻木酚素得率的影響（見圖6）。由圖6可知，超聲15 min時木酚素得率最高為6.9 mg／g。15 min后略有下降，可能是因?yàn)殡S超聲處理時間延長，會有少量亞麻膠溶出，使得系統(tǒng)中黏度增加，阻礙木酚素溶出，而導(dǎo)致其得率下降。綜合考慮考察指標(biāo)和試驗(yàn)需求，超聲時間考查水平值定為15 min。

圖6 提取時間對亞麻木酚素得率的影響

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料，超聲功率400 W條件下，分別以液固比、超聲溫度和超聲時間為考察因素，以木酚素得率為試驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析及二次回歸模型的擬合

通過Design－Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，方差分析如表3所示。在一次項(xiàng)中，液固比X1對提取物得率的影響達(dá)到極顯著水平（P ＜0．01），在二次項(xiàng)中，液固比X21、超聲溫度X22和超聲時間X23均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），這表明3個因素與亞麻木酚素的得率有直接關(guān)系，是主要的限制因子，其較小的變化可引起得率相當(dāng)大的改變。由于各因素對亞麻木酚素得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因子對其的影響，因此采用軟件對木酚素的得率進(jìn)行二次回歸模型擬合，回歸方程如下：

方程的顯著性分析得F＝9．485 319，相應(yīng)的概率值P＜0.01，表明該方程模型極顯著，不同處理間的差異高度顯著。失擬項(xiàng)值為0.487 7沒有達(dá)到顯著水平，表明非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響不大，說明該模型適合亞麻木酚素提取條件的篩選。

表3 回歸模型的方差分析

2.3.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對應(yīng)于試驗(yàn)因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖7可以看出，亞麻木酚素得率同液固比與超聲溫度具有明顯的二次拋物線關(guān)系，并且二者有明顯的交互作用，在超聲溫度較低時，得率隨液固比的增加而提高，隨著溫度的升高，增加幅度減小甚至下降，表明在不同溫度下，液固比對得率的影響也不同；圖8顯示液固比與超聲時間具有明顯的交互作用，得率隨超聲時間的增加先增加后減?。粓D9顯示在較小的超聲溫度下，得率隨超聲時間的延長而增大，在較大超聲溫度下，得率隨時間的增加而減小。

圖7 液固比和超聲溫度對亞麻木酚素得率的影響

圖8 液固比和超聲時間對亞麻木酚素得率的影響

圖9 超聲溫度和超聲時間對亞麻木酚素得率的影響

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

由響應(yīng)面圖可知，當(dāng)其中兩個變量取最佳值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)在另一項(xiàng)的設(shè)計(jì)取值范圍內(nèi)，說明響應(yīng)面各變量設(shè)計(jì)良好，可以求解響應(yīng)值最高點(diǎn)。用Design－Expert 8.0軟件中的Box－Benhnken模塊對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，獲得最優(yōu)的提取工藝條件為：以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料，60%乙醇為提取溶劑，超聲功率400 W，液固比16.94∶1，超聲溫度40.44℃，超聲時間15.19 min，亞麻木酚素得率預(yù)測值為7.20%?？紤]到實(shí)際操作的便利，確定亞麻木酚素的提取工藝條件為：液固比17∶1，超聲溫度40℃，超聲時間15 min。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取工藝進(jìn)行亞麻木酚素提取試驗(yàn)，共進(jìn)行3次重復(fù)，平均得率為（7.18±0.005）mg／g。結(jié)果表明，亞麻木酚素在優(yōu)化后的得率與最大得率的預(yù)測值很接近，預(yù)測值與實(shí)測值之間具有良好的擬合性，充分驗(yàn)證了所建模型的有效性，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對亞麻木酚素得率的影響。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 亞麻木酚素抗氧化活性研究

IC50值常用來比較清除自由基能力的大小，IC50值越小，清除自由基的能力越強(qiáng)，表明其抗氧化能力就越強(qiáng)。從表5可以看出，亞麻木酚素對DPPH·、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力，清除率隨質(zhì)量濃度增加而變化，且清除能力大于VC，這可能與它的結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)［15］。酚羥基易與自由基反應(yīng)，形成大的共軛體系，使得自由基電子較為分散而比較穩(wěn)定，從而使SDG表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

表5 亞麻木酚素抗氧化活性

3 結(jié)論

3.1 采用Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法，建立了亞麻木酚素提取工藝優(yōu)化的數(shù)學(xué)回歸模型，Y ＝7．12 ＋0．38X1＋0．18X2＋0．056X3－0．21X1X2－0．037X1X3＋0．012X2X3－0．46X21－0．602X2－0．57X23。方差分析表明，建立回歸模型的“P＞F”值為0.003 6，小于0.01，表明該二次方程模型極顯著，可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行亞麻木酚素得率的預(yù)測。

3.2 亞麻木酚素超聲波輔助提取最佳條件：以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料，60%乙醇為提取溶劑，超聲功率400 W，液固比17∶1，超聲溫度40℃，超聲時間15 min。在此條件下亞麻木酚素得率為7.18 mg／g，試驗(yàn)可為工業(yè)化提取亞麻木酚素提供一定的技術(shù)依據(jù)。

3.3 亞麻木酚素對DPPH、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力，IC50值分別為145 mg／L、75 mg／L 和0.25 mg／L。

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Ultrasonic－Assisted Extraction Technology by Response Surface Methodology Optimization and Inoxidizability of Lignan in Flaxseeds

Li Huizhen Li Na Zhang Zhijun Li Xiaojun Chen Tie
（School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051）

With flaxseeds as raw material，the ultrasonic － assistant extraction of lignan in flaxseeds was studied.Through single － factor experiments，the effects of particle size，ultrasonic frequency，liquid to solid ratio，ultrasonic temperature and time on the yield of lignan in flaxseeds were investigated.On the basis of single－factor experiments，a quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up by using Box－Behnken core combination design and process optimization of ultrasonic extraction of lignan in flaxseeds，The study results showed that the optimal process conditions of ultrasonic － assistant extraction of lignan in flaxseeds were as follows：particle size 60 mesh of raw materials，extraction solvent 60%ethanol，ultrasonic power 400 W，liquid to solid 17∶1，ultrasonic temperature 40 ℃ and ultrasonic time 15 min，the yield of lignan in flaxseeds was 7.18 mg／g.The antioxidant activity study showed that abilities of lignan in flaxseeds to scavenge DPPH and hydrogen peroxide and superoxide anion were good and IC50were 145 mg／L、75 mg／L and 0.25 mg／L respectively.

flaxseed，lignan，ultrasonic，response surface methodology，antioxidant activities

S565.9

A

1003－0174（2016）08－0062－07

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2013－080）；山西省國際科技合作項(xiàng)目（2013081004）

2014－12－10

李會珍，女，1974年出生，副教授，植物提取與產(chǎn)品開發(fā)

張志軍，男，1973年出生，教授，植物資源開發(fā)與利用