中華補(bǔ)血草5種黃酮類(lèi)化合物抗氧化和抗腫瘤活性的比較

摘要：比較研究5種中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素的體外抗氧化和抗腫瘤活性。運(yùn)用MTT試驗(yàn)，檢測(cè)5種中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物對(duì)HepG2和Hela腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響；運(yùn)用DPPH自由基清除試驗(yàn)，檢測(cè)中華補(bǔ)血草黃酮的體外抗氧化活性。研究結(jié)果可知，5種中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物均顯示一定抗氧化和抗腫瘤活性，但其活性強(qiáng)弱存在差異。本試驗(yàn)條件下其抗腫瘤活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋耗鹃夭菟?槲皮素>異鼠李素、芹菜素>異槲皮苷；體外抗氧化能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋洪纹に?木樨草素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。結(jié)果表明，中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物木樨草素、槲皮素、異鼠李素、芹菜素等為中華補(bǔ)血草抗腫瘤作用的重要活性成分，抗腫瘤作用與其抗氧化活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：中華補(bǔ)血草；黃酮；抗腫瘤；抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0297-03

收稿日期：2014-10-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81102817）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201210324004）；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2012JSSPITP2373）；江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（編號(hào)：JLCBE10006）。

作者簡(jiǎn)介：董蒙蒙（1991—），女，江蘇連云港人，主要從事植物藥藥理藥化學(xué)習(xí)和研究。E-mail：1249050523@qq.com。

通信作者：湯新慧，博士，教授，主要從事植物藥藥理藥化研究。Tel：（0515）88233191；E-mail：xinhuitang@sina.com。白丹花科補(bǔ)血草屬植物中華補(bǔ)血草[Limonium sinense （Girard） Kuntze]，別稱(chēng)匙葉草、鹽云草、海菠菜、海赤芍等，為多年生泌鹽草本植物，喜生于鹽漬化的低洼濕地上，主要分布于我國(guó)東北、華北、華東等濱海地區(qū)[1-2]。據(jù)記載，中華補(bǔ)血草各部位均可入藥，有清熱解毒、止血散瘀、祛風(fēng)消炎、抗癌、抗衰老的功效。民間常用其根治療肝癌，用葉治療胃潰瘍和胃癌，用花治療宮頸癌及各種出血[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該植物具有抗氧化、護(hù)肝、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖等多種藥理活性[5-11]。筆者研究顯示，該植物根醇提物安全低毒，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)抗化療藥物5-Fu的免疫抑制作用，且其本身也具有顯著抗腫瘤活性[12-13]。

中華補(bǔ)血草化學(xué)成分十分豐富，含有鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)、生物堿、多糖、萜類(lèi)、脂肪族化合物、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等[5，14-16]。特別是中華補(bǔ)血草總酚含量很高，占根提取物的55.55%，主要包括黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)和酚酸等，其中黃酮類(lèi)含量高達(dá)24.60%[8]，目前，已在中華補(bǔ)血草提取物中發(fā)現(xiàn)槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素、北美圣草素、高北美圣草素、楊梅樹(shù)皮素及其苷類(lèi)等20多種黃酮類(lèi)化合物[15，17-18]。已有研究證實(shí)，黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的生物活性和多種藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗誘變、抑制腫瘤形成與生長(zhǎng)等。近年來(lái)，關(guān)于黃酮類(lèi)化合物在腫瘤、心腦血管疾病等方面的應(yīng)用研究已經(jīng)比較深入，加上其低毒性的特點(diǎn)，已成為天然藥物和功能性食品研發(fā)的熱點(diǎn)之一。近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中華補(bǔ)血草總黃酮類(lèi)化合物具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖作用[19]，其同屬植物二色補(bǔ)血草中分離得到的黃酮類(lèi)化合物也具有顯著抗腫瘤活性[20]，黃酮類(lèi)化合物可能是該屬植物抗腫瘤作用的活性成分。

本研究采用MTT（四甲基噻唑藍(lán)）法，研究中華補(bǔ)血草中5種含量豐富的黃酮類(lèi)化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素[15，18]對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用，并運(yùn)用自由基清除試驗(yàn)比較其體外抗氧化活性，以期為中華補(bǔ)血草抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和該植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器Spectra Max190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn)；Thermo Form 311 型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司生產(chǎn)；TS100 型倒置光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司生產(chǎn)；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；MIS-3020全自動(dòng)高壓滅菌器，日本三洋電機(jī)公司生產(chǎn)。

1.1.2試劑MTT（四甲基噻唑藍(lán)），德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；胎牛血清、胰蛋白酶，美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3細(xì)胞株人肝癌 HepG2細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 、狀態(tài)良好的HepG2或Hela細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶消化液，使貼壁細(xì)胞脫落，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整至4.0×104個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液接種于96孔板，100 μL/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h后，將上述96孔板中的HepG2或Hela細(xì)胞分組，吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素，20 μmol/L 5-Fu（陽(yáng)性對(duì)照），每組設(shè)4個(gè)平行孔，并設(shè)陰性對(duì)照組（細(xì)胞培養(yǎng)液）、空白組（DMEM細(xì)胞懸液），給藥后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT試驗(yàn)按“1.2.1”節(jié)中方法在腫瘤細(xì)胞中加入5種中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物孵育48 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，MTT（5.0 g/L） 20 μL/孔，37 ℃孵育4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入MTT（1 g/L），100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO ，100 μL/孔，振蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解，用空白組調(diào)零，置酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（D570 nm），記錄結(jié)果并計(jì)算樣品的抑制率：抑制率=（1-D1/D0）×100%。式中：D1為供試樣品的吸光度；D0為陰性對(duì)照的吸光度。endprint

1.2.3DPPH自由基清除試驗(yàn)向96 孔板中分別加入 100 μL 含不同濃度異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素、維生素C（陽(yáng)性對(duì)照）的甲醇溶液，再分別加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，各化合物實(shí)際終濃度分別為625、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Di；同時(shí)測(cè)定不加DPPH 的樣品空白吸光度（Dj） 和加DPPH 但不加樣品（以樣品溶解液替代）的吸光度（Dk）。自由基清除率計(jì)算公式如下：清除率=[1-（Di-Dj）/Dk]×100%。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)（n=3），使用SPSS 11. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0. 05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1中華補(bǔ)血草5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)離體培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞增殖的影響

中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物對(duì)離體培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖1。5 種補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物中異鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素在6.25～100.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞體外增殖均顯示不同程度的抑制活性，抑制作用隨著濃度的增高而增強(qiáng)，隨著濃度升高至50 μmol/L時(shí)，化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制程度趨于平緩。對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞抑制活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋耗鹃夭菟?槲皮素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。其中100 μmol/L木樨草素、槲皮素、異鼠李素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用與20 μmol/L 5-Fu（抑制率543%，圖中未顯示）沒(méi)有明顯差異。異槲皮苷對(duì)HepG2 細(xì)胞體外增殖的抑制作用較弱，100 μmol/L異槲皮苷的HepG2增殖抑制率僅為20.3%。

2.2中華補(bǔ)血草5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)離體培養(yǎng)的Hela 細(xì)胞增殖的影響

5種中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物作用48 h對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)6.25～100.00 μmol/L異鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素可顯著抑制Hela腫瘤細(xì)胞體外增殖活性，抑制作用亦隨著濃度的增高而增強(qiáng)，100 μmol/L 4種化合物對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞抑制活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋洪夭菟?槲皮素>異鼠李素>芹菜素。木樨草素和槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用與20 μmol/L 5-Fu（抑制率402%）沒(méi)有明顯差異。6.25～100.00 μmol/L異槲皮苷對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞體外增殖無(wú)明顯影響。

2.3中華補(bǔ)血草5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)DPPH自由基的清除作用

5種化合物在6.25～200.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)均具有良好的DPPH自由基清除活性，并隨濃度的增加，清除作用增強(qiáng)（圖3）。其中，槲皮素對(duì)DPPH自由基清除作用最強(qiáng)，200 μmol/L 槲皮素的DPPH自由基清除率最高，達(dá)87.3%，高于陽(yáng)性對(duì)照維生素C組，5種黃酮化合物自由基清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋洪纹に?木樨草素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。

3討論與結(jié)論

黃酮類(lèi)化合物，別稱(chēng)生物類(lèi)黃酮，是以色酮環(huán)和苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的一類(lèi)化合物的總稱(chēng)，為植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛分布于自然界。目前已發(fā)現(xiàn)的黃酮類(lèi)單體化合物達(dá)9 000多種，研究證明，黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)提高抗氧化物酶的活性、清除自由基、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種渠道發(fā)揮抗腫瘤作用[21]，相關(guān)抗腫瘤活性引起了廣泛關(guān)注。目前已有多個(gè)黃酮類(lèi)化合物作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床。黃酮類(lèi)化合物已成為今后新藥開(kāi)發(fā)研究中值得重視的資源，具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。

中華補(bǔ)血草中黃酮類(lèi)化合物含量豐富，已有研究顯示，補(bǔ)血草屬植物黃酮類(lèi)化合物具有顯著抗腫瘤活性，黃酮類(lèi)化合物可能是中華補(bǔ)血草抗腫瘤作用的有效成分。本研究比較了中華補(bǔ)血草5種含量豐富的黃酮化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，中華補(bǔ)血草中5 種黃酮類(lèi)化合物均具有一定的體外抗腫瘤活性，但活性強(qiáng)弱存在差異。木樨草素、槲皮素、異鼠李素抗腫瘤活性較強(qiáng)，芹菜素次之，而異槲皮苷對(duì)HepG2 細(xì)胞體外增殖顯示較弱抑制作用，對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞體外增殖則無(wú)明顯影響。比較結(jié)構(gòu)類(lèi)似的2種化合物槲皮素與異槲皮苷發(fā)現(xiàn)，二者抗腫瘤活性存在明顯差異，可能是因?yàn)榉肿又蠧3 位的羥基被糖基取代，而C2-C3 位雙鍵是黃酮化合物抗腫瘤活性的一個(gè)關(guān)鍵因素，因此異槲皮苷抗腫瘤活性顯著下降[22]。

為進(jìn)一步明確中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物的抗腫瘤機(jī)制，本研究運(yùn)用DPPH自由基清除試驗(yàn)，比較5種黃酮類(lèi)化合物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)5種化合物在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均具有良好的DPPH自由基清除活性，并隨濃度的增加清除作用增強(qiáng)。其中槲皮素、木樨草素、異鼠李素抗氧化活性較強(qiáng)，異槲皮苷、芹菜素較弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，5種黃酮的抗腫瘤活性與抗氧化活性強(qiáng)弱比較接近，但并不完全一致，表明中華補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物抗氧化活性是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要因素，其他抗腫瘤機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究闡明。

參考文獻(xiàn)：

[1]董必慧. 江蘇沿海灘涂中華補(bǔ)血草的保護(hù)性研究[J]. 中國(guó)野生植物資源，2005，24（6）：28-30.

[2]郭巧生，蘇筱娟. 江蘇省沿海灘涂野生藥用植物生物多樣性及其保護(hù)[J]. 中國(guó)野生植物資源，1999，18（3）：30-32.

[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典：第2部[M]. 上海：上?？萍汲霭嫔纾?977.

[4]宋立人. 中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[5]Lin L C，Chou C J. Flavonoids and phenolics from Limonium sinense[J]. Planta Medica，2000，66（4）：382-383.endprint

[6]Kuo Y，Lin L C，Tsai W J，et al. Samarangenin B from Limonium sinense suppresses herpes simplex virus type l[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，46（9）：2854.

[7]李均，陳炳華，蘇安玲.中華補(bǔ)血草根提取物抗氧化活性的初步研究[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，24（3）：83-87，108.

[8]曲有樂(lè)，高 欣，崔宇鵬.中華補(bǔ)血草抗氧化活性研究[J]. 海峽藥學(xué)，2012，24（12）：33-36.

[9]Chaung S，Lin C C，Lin J，et al. The hepatoprotective effects of Limonium sinense against carbon tetrachloride and β-D-galactosamine intoxication in rats[J]. Phytotherapy Research，2003，17（7）：784.

[10]Tang X H，Gao J，Chen J，et al. Mitochondrial modulation is involved in the hepatoprotection of Limonium sinense extract against liver damage in mice[J]. Journal of Ethnopharmacology，2008，120（3）：427-431.

[11]Tang X H，Gao J，Chen J，et al. Expression of VDAC regulated by extracts of Limonium sinense Kuntze root against CCl4-induced liver damage[J]. International Journal of Molecular Sciences，2007，8：204-213.

[12]湯新慧，高靜，徐力致. 中華補(bǔ)血草用于制備抗腫瘤藥物的用途的制作方法：中國(guó)，ZL200610086169.9[P]. 2006-09-06.

[13]湯新慧，徐力致，高靜. 中華補(bǔ)血草根提取物抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）：917-918.

[14]Tang X H，Yan L F，Gao J，et al. Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from the root of Limonium sinense Kuntze[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2012，51（5）：1134-1139.

[15]劉興寬. 中華補(bǔ)血草的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2011，42（2）：230-233.

[16]湯新慧，沈敏. 補(bǔ)血草屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（8）：1874-1876.

[17]魏友霞，王軍憲，姚鴻萍. 補(bǔ)血草屬植物化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 西北藥學(xué)雜志，2007，22（4）：222-224..

[18]喻樊. HPLC法同時(shí)測(cè)定瀕危植物——中華補(bǔ)血草中異槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量[J]. 藥物分析雜志，2014，34（4）：632-635.

[19]張銘清. 中華補(bǔ)血草黃酮抑制白血病細(xì)胞增殖的初探[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（1）：54-55.

[20]張連茹. 二色補(bǔ)血草水溶性多糖、多酚類(lèi)和揮發(fā)性成分的研究[D]. 武漢：武漢大學(xué)，2004.

[21]張玉萌，鄭作文. 黃酮類(lèi)化合物抗腫瘤作用分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2006，3（6）：50-53.

[22]Rubio S，Quintana J，Lopez M，et al. Phenylbenzopyrones structure-activity studies identify betuletol derivatives as potential antitumoral agents[J]. European Journal of Pharmacology，2006，548（1/2/3）：9-20.苗琦，羅光明，羅揚(yáng)婧，等. 梔子全國(guó)生產(chǎn)區(qū)劃中指標(biāo)成分多波長(zhǎng)HPLC方法建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：300-302.endprint