Akt、TGF－β1、mTOR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

孫 琦

（撫寧縣人民醫(yī)院 河北撫寧 066300）

結(jié)直腸癌為常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤疾病，隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，較多的物理或化學(xué)致癌因子產(chǎn)生，外加人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，使結(jié)直腸癌的患病率逐年呈上升趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：［1］結(jié)直腸癌的患病增長(zhǎng)速度占據(jù)所有癌癥的首位，且發(fā)病時(shí)期直接影響著治療效果。對(duì)于常規(guī)切除手術(shù)來(lái)說(shuō)，若于患者癌變組織分化嚴(yán)重或出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)病晚期進(jìn)行手術(shù)，則術(shù)后5年內(nèi)的存活率只有50%左右，而于患者發(fā)病早期，癌變組織分化尚未嚴(yán)重及淋巴未發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)進(jìn)行手術(shù)，則術(shù)后5年內(nèi)的存活率可高達(dá)90%左右，因此盡早的對(duì)該病進(jìn)行確診并及時(shí)采取治療措施，是有效防止其惡化的途徑。所以，眾多研究將結(jié)直腸癌的治療關(guān)鍵放于病情判定指標(biāo)上。有相關(guān)研究報(bào)道：Akt、TGF－β1、mTOR參與細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控，于是本次研究分析了Akt、TGF－β1、mTOR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義，先將具體內(nèi)容進(jìn)行若下報(bào)道。

1 資料和方法

1．1 一般資料：選取2013年3月至2014年4月于我院手術(shù)后診斷為結(jié)直腸癌的標(biāo)本40例為癌變組，其中男性23例，女性17例，年齡26～67歲，平均年齡（42．1±13．2）歲；依照 AJCC結(jié)直腸癌TNM分期，Ⅰ＋Ⅱ期14例，Ⅲ＋Ⅳ期26例；依照分化程度：高度12例，中度18例，低度10例；依照淋巴轉(zhuǎn)移：淋巴有轉(zhuǎn)移18例，淋巴無(wú)轉(zhuǎn)移22例。另選取20例健康者的非結(jié)直腸癌變組織為非癌變組，男性11例，女性9例，年齡25～67歲，平均年齡（41．7±12．8）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：［2］臨床資料完整，手術(shù)后經(jīng)經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師鑒定確診為結(jié)腸癌變；術(shù)后癌變組織標(biāo)本完好保存，患者及家屬自愿參與研究，簽署自愿協(xié)議書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：［3］排除結(jié)直腸癌家族史，及使用化療、放療或非甾體抗炎藥物史的患者；排除并發(fā)其它部位惡性腫瘤的患者，排除臨床資料不完整者及未簽署自愿協(xié)議書(shū)者。

1．2 研究所用試劑與儀器：購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司Akt、TGF－β1、mTOR三者各自的兔抗人多克隆抗體；購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司的DAB試劑盒、S－P試劑盒、鏈親和素一過(guò)氧化物酶；儀器主要為購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司的切片機(jī)、烘干機(jī)、電子顯微鏡及國(guó)產(chǎn)的37℃恒溫孵育箱等。

1．3 免疫組化染色法操作步驟：石蠟包埋、切片、洗液清洗脫蠟；酒精浸泡、抗原還原、洗液清洗；滴加氧化酶阻斷劑，洗液沖洗；滴加山羊血清工作液；滴加45μl一抗，低溫放置后洗液沖洗；滴加45μl二抗，靜置后洗液沖洗；滴加鏈親和素一過(guò)氧化物酶，放置，洗液沖洗；滴加現(xiàn)配顯色劑（DAB）；蘇木素染色，水洗；酒精脫水封片待用；于顯微鏡下觀察Akt、TGF－β1、mTOR三者的表達(dá)陽(yáng)性率。

1．4 Akt、TGF－β1、mTOR陽(yáng)性診斷方法：依照文獻(xiàn)診斷方法：Akt、TGF－β1、mTOR三者表達(dá)蛋白染色成功的標(biāo)志均為［4］：細(xì)胞液被染成顆粒狀棕黃色物質(zhì)。于光鏡下取1000個(gè)腫瘤細(xì)胞觀察，最終結(jié)果以染色面積與染色程度的乘積得分進(jìn)行綜合評(píng)定［5］，其中染色面積得分規(guī)定為若染色成功細(xì)胞率為0%則計(jì)分為0分；若＜25% 則計(jì)分為1分；25%～40%計(jì)分為2分；41%～80%為3分；超過(guò)80%為4分。染色程度則按照棕褐色、棕黃色、黃色、無(wú)顯色分別為3分、2分、1分、0分。最終染色面積得分與染色程度得分若為0分則為陰性，以“－”表示，若為1～2分則為若陽(yáng)性，以“＋”表示，若為3分則為陽(yáng)性，以“＋＋”表示，若≥4分則為強(qiáng)陽(yáng)性，以“＋＋＋”表示［6］。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：研究中Akt、TGF－β1、mTOR陽(yáng)性率及患者的年齡、性別、癌變組織病理分型等臨床資料均應(yīng)用SPSS21．0軟件處理，其中計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)Akt、TGF－β1、mTOR陽(yáng)性率以百分號(hào)計(jì)數(shù)，組間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)患者年齡等以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以p值＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2．1 兩組研究對(duì)象結(jié)直腸組織中Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率比較：癌變組研究對(duì)象結(jié)直腸癌變組織中的Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率較非癌變組研究對(duì)象的健康結(jié)直腸組織明顯提升，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，p值均＜0．05，由此可見(jiàn)：結(jié)直腸組織癌變時(shí)Akt、TGF－β1、mTOR三者的表達(dá)陽(yáng)性率明顯上升，因此三者表達(dá)陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌變呈正相關(guān)，見(jiàn)表1。

2．2 不同病理分型間Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率差異比較：對(duì)于結(jié)直腸組織癌變患者，III＋I(xiàn)V期患者的癌變組織中Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于I＋I(xiàn)I期，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，p值均＜0．05，由此可見(jiàn)癌變組織中 Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率與TNM分期具顯著相關(guān)性；而隨著癌變組織分化程度的升高，Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，p值均＜0．05，由此可見(jiàn)癌變組織中Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率與癌變組織分化程度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)；有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的患者，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，P＜0．05，由此可見(jiàn)：Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)，見(jiàn)表2。

表1 兩組研究對(duì)象結(jié)直腸組織中Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率比較

表2 不同病理分型間Akt、TGF－β1、mTOR表達(dá)陽(yáng)性率差異比較

2．3 Akt、TGF－β1、mTOR分別及聯(lián)合用于結(jié)直腸癌診斷的性能比較：Akt、TGF－β1、mTOR三者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的準(zhǔn)確度為91．7%，敏感性為90%，特異性為95%，顯著高于三者單獨(dú)用于診斷的準(zhǔn)確度、敏感性及特異性，P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)意義。表明：Akt、TGF－β1、mTOR三者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌具更高的準(zhǔn)確度，值得臨床推廣應(yīng)用，見(jiàn)表3。

表3 Akt、TGF－β1、mTOR分別及聯(lián)合用于結(jié)直腸癌診斷的性能比較

3 討 論

3．1 Akt與結(jié)直腸癌：Akt（也可縮寫(xiě)為PKB）為絲氨酸與蘇氨酸類(lèi)的蛋白激酶也叫B類(lèi)蛋白類(lèi)激酶［7］，包括480個(gè)左右的氨基酸殘基，對(duì)機(jī)體細(xì)胞的繁殖及凋亡起著重要的調(diào)控作用。Akt主要通過(guò)磷酸活化一些細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子（白介素家族、mTOR等因子）間接對(duì)細(xì)胞的生理代謝與凋亡起到調(diào)節(jié)作用，而pAkt則為Akt磷酸活化調(diào)控因子后的產(chǎn)物，當(dāng)前眾多研究將Akt及pAkt共同作為癌變組織診斷的評(píng)定指標(biāo)［8］，且診斷的特異性、敏感性及準(zhǔn)確度均較高。本次研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，研究中發(fā)現(xiàn)Akt在結(jié)直腸癌組織癌變組的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于非癌變組，且在各分期、分化程度、是否淋巴轉(zhuǎn)移的病理分型中均表現(xiàn)出顯著差異，由此可以得出結(jié)論：Akt與結(jié)直腸癌及病情發(fā)展有明顯相關(guān)性。

3．2 TGF－β1與結(jié)直腸癌：TGF－β1為一種對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖分化周期等具有調(diào)控作用的多肽鏈，其主要通過(guò)與受體結(jié)合后發(fā)揮作用。研究證實(shí)：TGF－β1與相應(yīng)受體結(jié)合后主要通過(guò)介導(dǎo)smads的信號(hào)通路以間接對(duì)細(xì)胞起到調(diào)控作用［9］，但研究尚未得出其明確的作用機(jī)制。研究報(bào)道：TGF－β1對(duì)癌變細(xì)胞具有雙重調(diào)控作用，一方面在惡性腫瘤早期，：TGF－β1會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的分裂、擴(kuò)散、生長(zhǎng)等起的抑制作用，另一方面當(dāng)腫瘤細(xì)胞累積到一定的范圍與數(shù)量時(shí)，TGF－β1對(duì)腫瘤細(xì)胞失去調(diào)控能力，腫瘤細(xì)胞開(kāi)始無(wú)限制的生長(zhǎng)及分裂，與此同時(shí)，TGF－β1能夠刺激腫瘤血管的生長(zhǎng)，為腫瘤細(xì)胞的繁殖提供足夠的養(yǎng)料和血液，由此我們可以推測(cè)，TGF－β1可能與癌變組織的病情發(fā)展程度相關(guān)。大量研究證實(shí)：TGF－β1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌變、前列腺癌變、膀胱癌變、乳腺癌變、宮頸癌變等多種惡性腫瘤疾病有關(guān)，癌變組織中TGF－β1的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于非癌變相應(yīng)組織。本次研究證實(shí)：結(jié)直腸癌變組的TGF－β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，且隨著分期不同，分化程度不同，以及是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，TGF－β1的表達(dá)陽(yáng)性率均呈現(xiàn)顯著差異，由此可見(jiàn)：TGF－β1與結(jié)直腸癌及病情發(fā)展有明顯相關(guān)性。

3．3 mTOR與結(jié)直腸癌：mTOR為一類(lèi)蛋白質(zhì)物質(zhì)，對(duì)人體蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究證實(shí)：mTOR通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂時(shí)所需的養(yǎng)料及氧氣對(duì)其發(fā)揮調(diào)控作用，除此，mTOR信號(hào)通路在mTOR調(diào)控細(xì)胞中也起著關(guān)鍵性的作用，mTOR信號(hào)通路通過(guò)控制mTOR的表達(dá)量間接調(diào)控細(xì)胞，這便與TGF－β1（可通過(guò)介導(dǎo)smads的信號(hào)通路以間接對(duì)細(xì)胞起到調(diào)控作用）調(diào)控癌變細(xì)胞生長(zhǎng)分裂作用有了交集。另外mTOR對(duì)癌變細(xì)胞的凋亡起著顯著的調(diào)控作用：mTOR能夠明顯降低細(xì)胞抗凋亡因子的活性，并促進(jìn)促凋亡因子的表達(dá)，從而促進(jìn)癌變細(xì)胞的死亡。相關(guān)研究證實(shí)：mTOR的表達(dá)與多種組織癌變具有正相關(guān)性作用，而在本次研究中證實(shí)了此結(jié)論的正確性，研究中顯示：癌變組織中mTOR的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于非癌變相應(yīng)組織。本次研究證實(shí)：結(jié)直腸癌變組的mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，且隨著分期不同，分化程度不同，以及是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，mTOR的表達(dá)陽(yáng)性率均呈現(xiàn)顯著差異，由此可見(jiàn)：mTOR與結(jié)直腸癌及病情發(fā)展有明顯相關(guān)性。

本次研究還對(duì)Akt、TGF－β1、mTOR三者聯(lián)合及單獨(dú)用于結(jié)直腸癌診斷的準(zhǔn)確度、敏感性、特異性進(jìn)行了比較，證實(shí)三者聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確度、敏感性、特異性明顯高于單獨(dú)檢測(cè)。由此，綜上所有分析：Akt、TGF－β1、mTOR三者的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)病具顯著相關(guān)性，且隨著TNM分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移情況不同而表現(xiàn)顯著差異，且三者聯(lián)合用于結(jié)直腸癌病情程度的診斷具有較高的敏感性、特異性及準(zhǔn)確度，因此Akt、TGF－β1、mTOR三者表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)結(jié)直腸癌變的病理程度及治療有一定的指導(dǎo)意義。

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