芡實谷蛋白提取工藝優(yōu)化及其亞基組成分析

黎 衛(wèi) 毛 健 陳 婷 齊 斌

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

芡實(Euryale ferox)，又名雞頭米、雞頭蓮，屬于睡蓮科芡屬，是傳統(tǒng)的中藥材和珍貴的天然補品，具有藥食同源性。素有“水中人參”和“水中桂圓”美譽的芡實主要分布在東亞、南亞及東南亞等溫帶及亞熱帶區(qū)［1］。

芡實中含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)的含量與金針菜、銀耳、木耳等相當［2］。芡實不僅營養(yǎng)豐富，而且還有養(yǎng)血安神、止瀉止帶、益腎固精等食療功效［3］，在食品保健與醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于芡實蛋白的研究主要集中在芡實蛋白的超聲提?。?］、營養(yǎng)價值［5－7］、凝膠性及流變特性［8］等方面，而對于芡實蛋白組分提取分離的研究報道較少。根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性不同，按照Osborne分級法［9］植物蛋白可分為:溶于水的清蛋白(albumin);不溶于水，但溶于鹽的球蛋白(globulin);不溶于水，但溶于70% ～80%乙醇的醇溶蛋白(prolamine);不溶于水、醇，但溶于稀酸或稀堿的谷蛋白(glutelin)。本實驗室通過前期研究發(fā)現(xiàn)芡實蛋白的這4種組分中谷蛋白含量最高。國內(nèi)外關(guān)于谷蛋白的研究主要集中在大米［10－13］、小麥［14，15］、玉米［16，17］等農(nóng)作物蛋白源，對其進行了大量的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用，市場前景十分可觀，而關(guān)于芡實谷蛋白的提取工藝研究鮮有報道。因此利用響應(yīng)面法對芡實蛋白中主要組分谷蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，并通過SDS—PAGE凝膠電泳對芡實谷蛋白亞基組成進行分析，為進一步開發(fā)利用芡實谷蛋白提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

芡實:蘇州創(chuàng)德興芡實有限公司;

考馬斯亮藍G-250:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白:生物試劑，上海信然實業(yè)有限公司;SDS－PAGE凝膠快速配制試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所;

其他試劑:均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

試驗用水為蒸餾水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

水浴恒溫振蕩器:SHZ-28A型，太倉市華美生化儀器廠;

高速冷凍離心機:CR22GⅡ型，日本Hitachi公司;

紫外可見分光光度計:UVmini-1240型，日本Shimadzu公司;

冷凍干燥機:Alpha 1-2 LD plus型，德國Christ公司;

pH計:Seven Easy S20K型，瑞士Mettler Toledo公司;

分析天平:XS105 DualRange型，瑞士 Mettler Toledo公司;

電泳儀:Mini-PROTEAN Tetra型，美國 Bio-Rad伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 原料基本成分測定 將芡實粉碎后過100目篩，對其基本成分進行測定。測定方法:

(1)水分的測定:按GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中的直接干燥法執(zhí)行;

(2)蛋白的測定:按GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法執(zhí)行，N取6.25;

(3)脂肪的測定:按GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中的索式抽提法執(zhí)行;

(4)灰分的測定:按GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》中的質(zhì)量法執(zhí)行;

(5)總糖的測定:采用苯酚—硫酸法［18］。

1.2.2 芡實谷蛋白的提取 根據(jù)文獻［10］，修改如下:稱取10.0 g芡實粉，依次用 10 倍體積的水、0.1 mol/L NaCl溶液和70%乙醇溶液提取芡實清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白組分，重復(fù)提取兩次，12 000 r/min，4℃離心20 min去除上清液后，收集沉淀，洗滌2次，加入NaOH溶液攪拌，提取谷蛋白。

單因素試驗:設(shè)定液料比10(V/m)、溫度45℃、攪拌時間2 h、堿濃度(NaOH)4.0 g/L，固定其他條件，分別考察不同液料比、溫度、時間、堿濃度對芡實谷蛋白提取率的影響。提取后溶液離心(12 000 r/min、20 min、4℃)得上清液，重復(fù)提取兩次，將上清液混合，用1 mol/L的HCl調(diào)至其等電點，離心(12 000 r/min、20 min、4 ℃)，沉淀用 1︰2(m ︰ V)水洗滌兩次。沉淀加水溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，4℃透析48 h脫鹽。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥。冷凍干燥后的樣品即為芡實谷蛋白。每組試驗重復(fù)3次，取平均值。采用凱氏定氮法測定芡實谷蛋白的蛋白含量。

芡實谷蛋白提取率的計算:

式中:

R1——芡實谷蛋白的提取率，%;

m1——芡實谷蛋白的蛋白總質(zhì)量，g;

m2——原料中蛋白的總質(zhì)量，g。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以芡實谷蛋白的提取率作為響應(yīng)值，通過四因素三水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗重復(fù)3次，取平均值，建立回歸方程模型。

1.2.4 芡實谷蛋白等電點的測定 將提取的芡實谷蛋白溶液，分裝到21支離心管中，每管100 mL，用1 mol/L HCl調(diào)至不同的 pH(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，每組3 個平行，靜置2 h后在4℃、12 000 r/min離心20 min，測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，計算蛋白質(zhì)的沉淀率。

式中:

R2——芡實谷蛋白沉淀率，%;

m1——酸沉前上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g;

m2——酸沉后上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

液體樣品蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法［19］。以牛血清白蛋白(1 mg/mL)作標準曲線，595 nm吸光度為橫坐標，牛血清蛋白濃度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為:Y=1.157 1X+0.002 7(其中，X為吸光值;Y為蛋白濃度，單位為 mg/mL)，R2=0.993。

繪制沉淀率與pH值的曲線圖，沉淀率最大時的pH值即為芡實谷蛋白的等電點。

1.2.5 芡實谷蛋白的SDS—PAGE電泳 取最佳條件下提取的芡實谷蛋白粉，加入上樣Buffer，100℃煮沸5 min后，取15 μL上樣，采用5%濃縮膠及12%分離膠進行不連續(xù)垂直電泳，濃縮膠和分離膠電壓分別為70 V和100 V。待溴酚藍條帶移動到距離分離膠下邊緣1 cm左右時關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。采用考馬斯亮藍G-250染液對凝膠進行染色，用脫色液脫色后拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實的基本成分分析

將芡實粉碎后，過100目篩，采用1.2.1的方法測定芡實的基本成分，結(jié)果見表1。由表1可知，芡實中糖含量最高(83.23±0.83)%，其次是蛋白質(zhì)(9.52 ±0.13)%，印度學(xué)者［7］發(fā)現(xiàn)，芡實蛋白含量雖不高，但其必需氨基酸指數(shù)(EAAI)較高，優(yōu)于大部分的動植物蛋白。在本實驗室的前期研究中，谷蛋白為芡實蛋白中的主要組分，因此以堿溶酸沉法制備芡實谷蛋白，優(yōu)化其提取工藝，對提高其應(yīng)用范圍和經(jīng)濟價值具有重要意義。

表1 芡實的基本成分(干基)Table 1 The composition of Euryale ferox seed(10 －2g·g－1)

2.2 芡實谷蛋白的等電點

不同pH條件下，芡實谷蛋白的沉淀效果見圖1。由圖1可知，當pH為4.5～5.5時，芡實谷蛋白的沉淀效果較好，沉淀率在80%以上;當pH為5.0時，沉淀率達到最大值，為88.2%。因此芡實谷蛋白的等電點為5.0左右，確定此pH為芡實谷蛋白的最佳沉淀條件。

圖1 pH對芡實谷蛋白沉淀效果的影響Figure 1 Effect of different pH on the precipitation of Euryale ferox glutelin

2.3 單因素試驗結(jié)果

圖2 液料比對芡實谷蛋白提取率的影響Figure 2 Effect of liquid/material ratio on extraction yield of Euryale ferox glutelin

2.3.1 液料比對芡實谷蛋白提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增加，芡實谷蛋白的提取率不斷增加，當液料比為10.0(V/m)時，芡實谷蛋白提取率達31.17%，此后，隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)的提取率幾乎不變。當液料比較小時，溶液的黏度過大，不利于蛋白溶出;當液料比過大時，不利于蛋白質(zhì)提取后的濃縮沉淀。綜合考慮，單因素試驗確定的最佳液料比為10.0(V/m)。

2.3.2 溫度對芡實谷蛋白提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，芡實谷蛋白的提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在50℃達到最大值。較高的溫度有利于蛋白質(zhì)的溶出，但是溫度過高時，易導(dǎo)致蛋白變性，因此，單因素試驗確定的最佳提取溫度為50℃。

圖3 溫度對芡實谷蛋白提取率的影響Figure 3 Effect of temperature on extraction yield of Euryale ferox glutelin

2.3.3 時間對芡實谷蛋白提取率的影響 由圖4可知，提取時間在0.5～2.0 h時，芡實谷蛋白的提取率隨著時間的延長而顯著增加，超過2.0 h后芡實谷蛋白的提取率增加緩慢，并且有降低的趨勢。原因可能是隨著時間的延長，蛋白充分的溶解，在其達到飽和后，蛋白濃度就不再升高。在較高溫度下，提取時間過長也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而提取率降低?？紤]到在高溫下蛋白質(zhì)的品質(zhì)以及能源耗用問題，確定最佳提取時間為2.0 h。

圖4 時間對谷蛋白提取率的影響Figure 4 Effect of time on extraction yield of Euryale ferox glutelin

圖5 堿濃度對谷蛋白提取率的影響Figure 5 Effect of sodium hydroxide concentration on extraction yield of Euryale ferox glutelin

2.3.4 堿濃度對芡實谷蛋白提取率的影響 由圖5可知，當NaOH濃度在1.0～4.0 g/L時，隨著堿濃度的升高，芡實谷蛋白的提取率顯著增加。此后隨著NaOH濃度的升高，芡實谷蛋白的提取率反而降低。原因可能是，稀堿有利于蛋白質(zhì)的提取，當堿濃度達到4.0 g/L時，溶液蛋白質(zhì)濃度達到最大，當超過這一濃度，蛋白質(zhì)的提取率降低，過高的堿濃度會使蛋白變性，使得溶解度下降，改變其營養(yǎng)學(xué)特性，生成有毒物質(zhì)［20］。綜合考慮，確定最佳提取堿濃度為4.0 g/L。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面法因素與水平的選擇 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用四因素三水平的響應(yīng)面法，因素編碼及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Coded values and corresponding actual values of the variables used in Box-Behnken design

2.4.2 回歸模型的建立與檢驗 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。按照Design Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken Design方法，4個因素經(jīng)過擬合得到的芡實谷蛋白提取率(Y)的回歸方程為:

對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，該模型達到極顯著水平(P＜0.01)，失擬項不顯著(P＞0.05)，該模型的R2值為0.964 3，說明該模型與試驗擬合良好，故可用于設(shè)計范圍內(nèi)的預(yù)測。

由表4回歸模擬系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，一次項中，B、D極顯著，A、C顯著;平方項中，除C2顯著外，其余平方項均為極顯著，二次項中，BD的回歸系數(shù)達到顯著水平，其他交互項均不顯著。影響芡實谷蛋白提取率因素的主次順序依次為D＞B＞A＞C，即堿濃度＞溫度＞液料比＞時間。

2.4.3 兩因素間交互效應(yīng)分析 根據(jù)芡實谷蛋白模型的回歸方程，固定兩個因素在編碼值0的水平，分析另外兩個因素對芡實谷蛋白的影響，軟件生成的三維響應(yīng)面圖，可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，從而確定最佳工藝參數(shù)。

表3 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and results

由表4可知，溫度和堿濃度的交互作用對芡實谷蛋白的提取率有顯著影響，而其他因素間的交互作用對芡實谷蛋白的提取率影響不大。固定液料比和提取時間在0水平，作出溫度和堿濃度的交互效應(yīng)的響應(yīng)面，見圖6。根據(jù)響應(yīng)面的陡峭程度可知，溫度對芡實谷蛋白提取率的影響較堿濃度小，這與方差分析的結(jié)果相一致。該結(jié)果與趙潔昌［21］在優(yōu)化酸棗仁蛋白的提取工藝中的研究結(jié)果一致。隨著溫度和堿濃度的升高，蛋白提取率表現(xiàn)出顯著的先增后減的趨勢。若想獲得較高的提取率，溫度應(yīng)在50℃左右、堿濃度在4.5 g/L左右。

表4 回歸模擬方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

圖6 溫度和堿濃度的交互作用對芡實谷蛋白提取率的影響Figure 6 Response surface plot showing the effect of sodium hydroxide concentration and temperature on extraction yield of Euryale ferox glutelin

2.4.4 最佳條件優(yōu)化及驗證結(jié)果 通過響應(yīng)面回歸方程，經(jīng)Design Expert 8.05b軟件對芡實谷蛋白提取進行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件為:液料比10.3(V/m)，溫度51℃，時間2.2 h，堿濃度4.5 g/L，理論預(yù)測值為32.55%。根據(jù)最佳工藝條件，做3組驗證性實驗，得到芡實谷蛋白提取率分別為 32.43%，32.52%，32.39%，平均值為 32.45%，與該模型理論預(yù)測值32.55%無顯著差異(P＞0.05)，表明該響應(yīng)面模型是可行的。

2.5 芡實谷蛋白的亞基組成

通過前期提取工作，在最佳條件下提取的芡實谷蛋白通過SDS—PAGE凝膠電泳分析，取得了較好的分離效果，結(jié)果見圖7。由圖7可知，芡實谷蛋白主要有5個亞基，相對分子量分別為74，58，49，33，15 kD。其中15 kD 亞基含量最高，為52.4%;其次為 74 kD(占15.5%)和 33 kD(占 15 .4%);最后為58 kD(占9.6%)和49 kD(占7.1%)。經(jīng)多次重復(fù)試驗，芡實谷蛋白電泳譜帶重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，這為構(gòu)建芡實谷蛋白指紋圖譜提供一定的依據(jù)。

圖7 芡實谷蛋白的SDS—PAGE分析Figure 7 SDS—PAGE profile of Euryale ferox glutelin

3 結(jié)論

本試驗通過堿提酸沉法提取制備芡實谷蛋白，采用響應(yīng)面法建立了芡實谷蛋白提取工藝參數(shù)的二次多項式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗該模型是合理可靠的，能較好地預(yù)測芡實谷蛋白的提取率。由該模型分析可知，影響芡實谷蛋白提取率因素的主次順序為:堿濃度＞溫度＞液料比＞時間;最佳提取工藝條件為:液料比10.3(V/m)，溫度51 ℃，時間2.2 h，堿濃度4.5 g/L。在此條件下，芡實谷蛋白提取率可達32.45%。通過對芡實谷蛋白SDS—PAGE凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)芡實谷蛋白中主要由5種亞基組成，其中15 kD亞基含量最高，占52.4%，經(jīng)多次重復(fù)試驗，芡實谷蛋白電泳譜帶重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，這為構(gòu)建芡實谷蛋白指紋圖譜提供一定的依據(jù)。

通過本次試驗可以為堿溶酸沉法提取芡實谷蛋白及芡實谷蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)性參考，今后可進一步研究芡實谷蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其功能特性，為其更好的應(yīng)用于食品行業(yè)提供理論基礎(chǔ)。

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