山核桃餅粕蛋白提取工藝的優(yōu)化

劉雙鳳 王華生

（湖南省農(nóng)林工業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究總院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是胡桃科山核桃屬植物，主要分布在浙、皖兩省交界的天目山一帶，是中國(guó)特產(chǎn)的優(yōu)良干果、油料樹(shù)種［1，2］。目前，山核桃大部分被用于油脂榨取，壓榨后的餅粕基本被直接丟棄［3］。研究［4，5］發(fā)現(xiàn)，山核桃餅粕中約含有20%的蛋白質(zhì)，其蛋白的效價(jià)與動(dòng)物蛋白相近，含有多種人體必需氨基酸，尤其是精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸的含量非常高，且必需氨基酸的含量比例合理，接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸配比，具有很高的食用價(jià)值和保健功能。

目前用于蛋白提取的方法主要有十六烷基三甲基溴化銨法、尿素法、脂肪酸鹽法、堿提酸沉法等［6］，其中堿提酸沉法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、提取率高，被廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中［7］，其在山核桃餅粕上的應(yīng)用也倍受關(guān)注。趙見(jiàn)軍等［8］曾對(duì)核桃粕中蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，但其采用的超聲波輔助浸提法，由于設(shè)備的限制離實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有一定距離。楊瑾等［9］曾優(yōu)化了堿提酸沉法提取山核桃餅粕的工藝，但其是以冷凍干燥后的粗蛋白為評(píng)價(jià)指標(biāo)，有失偏頗。

本課題汲取前人［8，9］的研究經(jīng)驗(yàn)并做適當(dāng)調(diào)整，以山核桃為原料，借助二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)堿提酸沉法提取山核桃餅粕蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為山核桃資源的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨山核桃餅粕：河北黃金龍食用油有限公司；

牛血清白蛋白：≥98.5%，上海金穗生物科技有限公司；

石油醚（60～90℃）、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

搖擺式粉碎機(jī)：DFY－500D型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；

智能型蒸餾器：HR－1000型，上海華睿儀器有限公司；

數(shù)顯定時(shí)消化爐：HR－08型，上海華睿儀器有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16－WS型，湖南湘儀科學(xué)設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－8型，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：FD－2A型，上海爭(zhēng)巧科學(xué)儀器有限公司；

臺(tái)式精密酸度計(jì)：TP310型，上海雷磁新涇儀器有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：722N型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

山核桃餅粕→粉碎（過(guò)30目篩）→干燥（50℃，24h）→脫脂（索氏抽提8h）→調(diào)至堿性（NaOH）→恒溫浸提→離心（3 000r/min，20min）→上清液→調(diào)至酸性（HCl）→離心（3 000r/min，20min）→沉淀→洗至中性（蒸餾水）→真空冷凍干燥（－10℃預(yù)凍12h，－30℃干燥24h）→山核桃蛋白

1.3.2 山核桃餅粕蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取山核桃餅粕20.0g于燒杯中，按料液比1∶15（m∶V）加入蒸餾水，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至9.0，于50℃的恒溫水浴鍋內(nèi)浸提120min。浸提完成后，3 000r/min離心20min，獲取上清液。取1mL待測(cè)液（將1mL的提取上清液定容至100.0mL）用分光光度計(jì)測(cè)吸光度值（在595nm波長(zhǎng)下），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（詳見(jiàn)1.3.6）計(jì)算出蛋白質(zhì)含量；另取7份15mL的上清液，以1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH 分別為 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，分別離心（3 000r/min，20min）并取1mL稀釋了100倍的上清液用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度值（在595nm波長(zhǎng)下），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（詳見(jiàn)1.3.6）計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。以式（1）計(jì)算山核桃餅粕蛋白質(zhì)的沉淀率，最大時(shí)的pH值即為其等電點(diǎn)。

式中：

R1——山核桃蛋白質(zhì)的沉淀率，%；

m1——酸沉前的蛋白質(zhì)含量，mg/mL；

m2——酸沉后的蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）提取時(shí)間：在提取溫度為50℃、料液比為1∶15（m∶V）、pH 為9.0的條件下，考察提取時(shí)間（30，60，90，120，150，180min）對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（2）提取溫度：在提取時(shí)間為120min、料液比為1∶15（m∶V）、pH 為9.0的條件下，考察提取溫度（40，45，50，55，60，65℃）對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（3）料液比：在提取時(shí)間為120min、提取溫度為55℃、pH為9.0的條件下，考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，m∶V）對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（4）pH值：在提取時(shí)間為120min、提取溫度為55℃、料液比為1∶20（m∶V）的條件下，考察pH（8，9，10，11，12）山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

1.3.4 二次正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，并考慮到TP310型臺(tái)式精密酸度計(jì)靈敏度的實(shí)際情況，固定浸提的pH為9.0不變，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比為試驗(yàn)因素，山核桃粕蛋白提取率為響應(yīng)值，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 山核桃餅粕中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 按GB 5009.5—2010執(zhí)行。

1.3.6 上清液中蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法。

（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照文獻(xiàn)［10］的方法，以蛋白質(zhì)含量（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程A＝4.951 4X－0.013 5（R2＝0.998）。

（2）對(duì)樣品的測(cè)定：將離心分離后的山核桃餅粕蛋白提取液定容至100mL，靜置后取出1mL稀釋100倍待測(cè)。測(cè)定時(shí)，取待測(cè)液1mL參照文獻(xiàn)［10］測(cè)吸光度A值，并計(jì)算蛋白含量。

1.3.7 蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定 蛋白質(zhì)提取率按式（2）計(jì)算：

式中：

R2——蛋白沉淀率，%。

m3——上清液蛋白含量，mg/mL；

m4——脫脂后山核桃餅粕中的蛋白含量，mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以珚x±s表示。運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平取P＜0.05（差異顯著）；借助DPS 7.05進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃餅粕蛋白等電點(diǎn)分析

由圖1可知，在浸提液pH為3.0～6.0時(shí)，隨著pH的增加，蛋白的沉淀率呈先增后減的趨勢(shì)，在pH為5.0時(shí)，沉淀率最大（P＜0.05）。這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的當(dāng)pH 值在5.0時(shí)蛋白質(zhì)沉淀迅速，離心后上清液清亮，效果較好的情況一致，故山核桃蛋白的等電點(diǎn)是pI為5.0。

圖1 pH對(duì)蛋白沉淀率的影響Figure 1 Ettects of pH values on protein deposition rate

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)山核桃餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，山核桃餅粕蛋白的提取率逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間為120min時(shí)，蛋白的提取率增幅趨于平緩（與150min時(shí)沒(méi)有顯著性差異，P＞0.05）。故提取時(shí)間宜控制在120min左右。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Figure 2 Ettects of different extraction time on protein yield

2.2.2 提取溫度對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為55℃時(shí)提取率達(dá)到最大值（P＜0.05）?？赡芘c蛋白質(zhì)分子構(gòu)象隨著提取溫度的升高而發(fā)生改變有關(guān)，提取溫度的升高，促進(jìn)了山核桃蛋白立體結(jié)構(gòu)的伸展，使其在水分子的熱運(yùn)動(dòng)下更易溶解［11］；當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，使得維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵斷裂，天然構(gòu)象解體，蛋白變性，提取率降低［12］。故提取溫度宜控制在55℃左右。

圖3 提取溫度對(duì)提取率的影響Figure 3 Ettects of different extraction temperature on protein yield

2.2.3 料液比對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)料液比≤1∶20（m∶V）時(shí)，蛋白提取率隨其增大而增加（P＜0.05），之后趨于穩(wěn)定?？赡苁窃谳^低料液比時(shí)，由于溶液的黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，體系分散不均勻，導(dǎo)致體系中的蛋白溶出困難；隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)更易溶出，因而提取率增加，直至其完全浸出，體系保持動(dòng)態(tài)平衡，提取率不再改變［13］。故料液比宜控制在1∶20（m∶V）左右。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響Figure 4 Ettects of different extraction solid－liquid ratio on protein yield

2.2.4 pH值對(duì)山核桃餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，當(dāng)pH值為9.0時(shí)蛋白提取率最高（P＜0.05），過(guò)高或者過(guò)低的pH值都不利于蛋白的提取。可能是蛋白的基本結(jié)構(gòu)中含有氨基和羧基兩種官能團(tuán)，不同的pH環(huán)境會(huì)影響其存在的方式，進(jìn)而改變?nèi)艹鲂Ч?。并考慮到TP310型臺(tái)式精密酸度計(jì)靈敏度的實(shí)際情況，確定后續(xù)試驗(yàn)提取液的pH 值為9.0。

圖5 pH值對(duì)提取率的影響Figure 5 Ettects of different extraction pH on protein yield

2.3 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的因素水平安排及試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1、2。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and code levels of quadratic orthogonal rotation combination design

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The test results of quadratic orthogonalrotation combination design

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合得到回歸方程：

由表3可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1＝2.598 20＜F0.01（5，8）＝3.69不顯著（P＝0.076 8＞0.05），說(shuō)明所選的二次回歸模型適當(dāng)；回歸顯著性檢驗(yàn)F2＝6.253 04＞F0.01（9，13）＝4.17極顯著（P＝0.004 7＜0.01），說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值接近，模型成立［9］。在α＝0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，得到簡(jiǎn)化后的回歸方程：

由式（4）的各項(xiàng)系數(shù)可知，對(duì)山核桃餅粕蛋白提取率影響較大的因素依次為X1（提取時(shí)間）＞X3（料液比）＞X2（提取溫度），且這3因素之間不存在差異顯著性（P＜0.05）的兩兩交互作用，故未列出等高線及交互作用圖。

由表4可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)當(dāng)提取時(shí)間為124～130min，提取溫度為53～57℃，料液比為1∶22～1∶26（m∶V），pH值9.0時(shí)，山核桃蛋白的提取率較高。為節(jié)約生產(chǎn)成本，在實(shí)際應(yīng)用中選定各因素的最低值，即提取時(shí)間124min，提取溫度53℃，料液比1∶22（m∶V），并進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其山核桃蛋白的平均提取率為（67.94±0.05）%，與預(yù)測(cè)最高值67.98%不存在顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明擬合所得的回歸方程能較好地指導(dǎo)山核桃蛋白的提取。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of test results

表4 各因素的頻率分布Table 4 The probability distribution of values of each variable

3 結(jié)論

（1）山核桃蛋白的等點(diǎn)電為pI 5.0，這與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的（pI 4.5～5.5）結(jié)果相近，但在該等電點(diǎn)下的最大沉淀率僅為89.8%，要低于文獻(xiàn)［6］報(bào)道的94.5%，可能是試驗(yàn)原料及蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的差異造成的。由于本試驗(yàn)選用的考馬斯亮藍(lán)法極易受到樣品中多糖等成分的干擾，所以其檢測(cè)線性范圍和結(jié)果的準(zhǔn)確性均比文獻(xiàn)［8］所用的雙縮脲法差，下一步將針對(duì)此進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以明確山核桃蛋白的等電點(diǎn)。

（2）山核桃蛋白的最佳提取條件為：pH 9.0，提取時(shí)間124min，提取溫度53℃，料液比1∶22（m∶V），在該條件山核桃餅粕蛋白的平均提取率為（67.94±0.05）%，與預(yù)測(cè)的最高值67.98%不存在顯著性差異（P＜0.05）?？紤]到考馬斯亮藍(lán)法僅能檢測(cè)水溶性蛋白［14］，故推測(cè)山核桃中的實(shí)際蛋白含量要高于該值，未來(lái)將借助于液相色譜等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行精確測(cè)定。

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