桉葉多酚連續(xù)相變提取工藝的優(yōu)化

譚榮威 曹 庸 利嘉城

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

桉樹（Eucalyptus robusta Smith）主要分布于亞洲、非洲和中南美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)，具有生長快、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)。于1890年引入中國，迄今已在廣西、四川和廣東等17個(gè)?。▍^(qū)）種植［1］。2013年，中國桉樹人工林面積約450萬hm2，桉樹葉產(chǎn)量超過2 000萬t［2］。研究［3－6］表明：桉樹葉中含有多酚、精油等活性成分。其中，多酚是桉樹葉中含量較高且抗氧化性強(qiáng)的一類天然活性物質(zhì)，其DPPH·清除率高于多酚含量為50%的茶多酚，與Vc相當(dāng)［7－10］。但目前，只有少部分桉樹葉用于精油提取，資源未得到充分利用。

目前用于植物多酚提取的方法主要有溶劑浸提法、微波、超聲波輔助萃取和超臨界萃取等［11］。本實(shí)驗(yàn)室［7］前期研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用溶劑浸提法提取桉葉，其多酚提取量為9.0～9.5g/100g，該法提取效率較低。同時(shí)，溶劑浸提法、微波和超聲波輔助萃取還存在提取后過濾困難，提取溶劑回收不便等問題。超臨界萃取法其設(shè)備制造成本和維護(hù)成本過高，且極高的壓力限制了設(shè)備容積的放大。連續(xù)相變提取裝置是一種新型高效流體提取裝置［12－14］。利用提取溶劑的反復(fù)相變，穩(wěn)定、高效地連續(xù)萃取目標(biāo)物。該方法較溶劑浸提法提取效率高，溶劑回收方便，損失率低，粗提取液無需過濾，本實(shí)驗(yàn)室利用該裝置已經(jīng)完成了多種天然活性物的中試提取生產(chǎn)，如陳皮油等［15］，已有產(chǎn)品在售。本試驗(yàn)擬用連續(xù)相變提取裝置提取桉葉多酚，探究提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)桉葉多酚提取量的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化分析，對(duì)相關(guān)工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而為桉葉多酚后續(xù)的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持，推動(dòng)桉葉廢物再利用的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

桉樹葉：“廣林9號(hào)”桉樹葉，2013年9月采自廣東茂名；

乙醇：分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；

Na2CO3：化學(xué)純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

福林—酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：生化試劑，美國Sigma－Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

連續(xù)相變提取裝置：本實(shí)驗(yàn)室自制；

紫外可見分光光譜儀：SKFG－0型，美國Pharmarcia Biotech公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R204B3型，上海申生科技有限公司；

超聲波清洗器：B1510型，美國Bransonic公司；

噴霧干燥儀器：HL－2000型，湖南海陵生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桉葉粗提物的制備 稱取自然陰干，過20～30目篩的桉葉粉末700g，裝入連續(xù)相變提取裝置，設(shè)定一定溫度、乙醇濃度進(jìn)行連續(xù)提取若干時(shí)間。取醇提液噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度80℃，霧化器轉(zhuǎn)速12 000r/min，供料泵流量4L/h），即得桉葉粗提物。4℃，密封狀態(tài)下避光保存。

1.2.2 多酚提取量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］測(cè)定桉葉粗提物的多酚含量，并按式（1）計(jì)算多酚提取量。

式中：

R——桉葉多酚提取量，g/100g；

m——桉葉粗提物質(zhì)量，g；

M——待提取的桉葉質(zhì)量，g；

C——桉葉粗提物中多酚含量，mg/g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在連續(xù)相變提取裝置中，提取溫度、提取時(shí)間、溶劑溶度和提取壓力是影響目標(biāo)物提取率的主要因素。根據(jù)前期試驗(yàn)探索及湯杰［16］的研究結(jié)果，本試驗(yàn)分別選取提取溫度、提取時(shí)間、溶劑溶度為試驗(yàn)單因素進(jìn)行研究。每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)3次。

（1）提取溫度對(duì)多酚提取量的影響：稱取自然陰干，過20～30目篩的桉葉粉末約700g，裝入提取釜中，在溶劑為80%乙醇的條件下，分設(shè)30，40，50，60，70，80℃共6個(gè)溫度梯度，提取時(shí)間為30min。提取液經(jīng)噴霧干燥成粉后，保存?zhèn)溆?，待多酚含量測(cè)定，并計(jì)算桉葉多酚提取量。

（2）乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響：稱取自然陰干，過20～30目篩的桉葉粉末約700g，裝入提取釜中，在60℃下分設(shè)40%，60%，70%，80%，95%共5個(gè)乙醇濃度梯度，提取時(shí)間為30min。后續(xù)步驟同1.2.3（1）。

（3）提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響：稱取自然陰干，過20～30目篩的桉葉粉末約700g，裝入提取釜中，在60℃，80%乙醇為溶劑的條件下，分設(shè)20，30，50，70，100，120min共6個(gè)提取時(shí)間梯度進(jìn)行提取。后續(xù)步驟同1.2.3（1）。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以桉葉多酚提取量為衡量指標(biāo)，通過Box－Benhnken中心組合法來進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋求桉葉多酚的最佳提取條件。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)桉葉多酚提取量的影響

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知，提取溫度從40℃向70℃遞變時(shí)，多酚提取量有所上升，影響趨勢(shì)不明顯；當(dāng)溫度由70℃升高至80℃時(shí)，桉葉多酚的提取量明顯升高。在溶劑浸提法中，隨著提取溫度的逐漸上升（30～70℃），桉葉中多酚提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)［16］，這是因?yàn)槿軇┙岱ㄖ袦囟壬邥?huì)造成多酚氧化加速，而連續(xù)相變提取裝置在工作中為完全密閉且真空的狀態(tài)，隔絕空氣，多酚物質(zhì)不易發(fā)生氧化?？紤]到連續(xù)相變提取裝置中，采用循環(huán)水加熱，其提取溫度最高為80～90℃。故選取40，60，80℃作為優(yōu)化連續(xù)相變提取法的3個(gè)提取溫度水平。

圖1 提取溫度對(duì)桉葉多酚提取量的影響Figure 1 Effect of extraction temperature on the extraction yield

2.1.2 乙醇濃度的影響 由圖2可知，乙醇濃度由40%向95%升高的過程中，多酚提取量先升高（6.80～7.48g/100g）后降低（7.48～2.73g/100g）。由于儀器客觀條件所限，較低乙醇濃度情況下，溶劑相變速度較慢，儀器無法連續(xù)工作。綜合各方面因素，選取40%，60%，80%作為優(yōu)化連續(xù)相變提取法的3個(gè)乙醇濃度水平。

圖2 乙醇濃度對(duì)桉葉多酚提取量的影響Figure 2 Effect of extraction solvent percentage on the extraction yield

2.1.3 提取時(shí)間的影響 由圖3可知，在提取時(shí)間由20min升至70min的過程中，桉葉多酚的提取量呈顯著上升趨勢(shì)（4.52～8.01g/100g），70～120min過程中，桉葉多酚的提取量變化趨勢(shì)不明顯。這是由于多酚類物質(zhì)在70min之內(nèi)基本能夠溶出。在溶劑浸提法中，桉葉多酚提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)，180min得到最高提取率［16］，這是因?yàn)槿軇┙岱ㄌ崛⌒实停喾犹崛∫罕┞对诳諝庵袝r(shí)間長易氧化。綜合考慮選取30，60，90min作為優(yōu)化連續(xù)相變提取法的3個(gè)提取時(shí)間水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)桉葉多酚提取量的影響Figure 3 Effect of extraction time on the extraction yield

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box－Benhnken中心組合來進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度為因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

采用Design－Expert 8.05b軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得線性回歸方程：

2.2.2 顯著性分析 由表3可知，模型為極顯著（P＝0.007 8＜0.01），回歸決定系數(shù)R2＝0.904 1，說明響應(yīng)值的變化有90.41%來自所選因素，由失擬項(xiàng)系數(shù)（P＝0.525 7＞0.05）不顯著，可知該回歸方程擬合度較好，可以利用該回歸方程確定連續(xù)相變提取桉葉多酚的最佳工藝條件。各因素中，一次項(xiàng)X2影響極顯著（P＜0.01），X1、X3影響顯著（P＜0.05）。交互項(xiàng)X1X2的影響也是極顯著的（P＜0.01），說明各單因素對(duì)響應(yīng)值的影響存在非線性的關(guān)系。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 由表3以及圖4、5可知，3個(gè)因素對(duì)于多酚提取量（Y）的影響皆顯著，影響強(qiáng)弱大小為提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度。提取時(shí)間與乙醇溶度、提取溫度與提取時(shí)間之間交互作用等高線圖呈橢圓形，說明提取時(shí)間與乙醇溶度、提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)桉葉多酚提取量存在影響，但前者影響極顯著，后者影響不顯著。

根據(jù) Design－Expert 8.05b軟件分析得出，在提取溫度79.99℃、提取時(shí)間119.98min、乙醇濃度78.13%的條件下，桉葉多酚提取量有最大值，其理論預(yù)測(cè)值為12.01g/100g。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface experiments

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression and variance

圖4 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)桉葉多酚提取量的影響Figure 4 Effect of extraction solvent percentage and extraction time on the extraction yield

圖5 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)桉葉多酚的影響Figure 5 Effect of extraction temperature and extraction time on the extraction yield

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為方便操作對(duì)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)進(jìn)行修整：提取溫度取80℃，提取時(shí)間取120min，乙醇濃度取78%。并按修整后的條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其桉葉多酚提取量為（11.58±0.83）g/100g，與理論預(yù)測(cè)值相近，相對(duì)偏差為3.65%。說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化后得到桉葉多酚連續(xù)相變提取工藝參數(shù)較為可信，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

2.2.5 連續(xù)相變提取法與超聲波輔助提取法提取桉葉多酚的對(duì)比 由表4可知，本方法通過優(yōu)化得到的最佳提取條件，相較超聲波輔助提取法有更高的提取率，更少的提取時(shí)間和提取次數(shù)，并且提取之后無需過濾、濃縮等步驟，即可通過噴霧干燥制成桉葉多酚產(chǎn)品，極大降低了多酚提取的成本。連續(xù)相變提取法較超聲波輔助提取法（超聲波輔助提取裝置、過濾裝置、濃縮裝置等）在前期設(shè)備投入方面相差不大，但具有較大節(jié)約生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)。

表4 連續(xù)相變提取法與超聲波輔助提取法提取桉葉多酚的對(duì)比Table 4 The comparison of continuous phase transition extraction progress and Ultrasonic assisted extraction technology on eucalyptus'polyphenols rate

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)研究了提取溫度、時(shí)間和乙醇溶度對(duì)連續(xù)相變技術(shù)提取桉葉多酚得率的影響。結(jié)果表明，最佳的提取工藝條件為：提取溫度80℃，提取時(shí)間120min，乙醇濃度78%，桉葉多酚提取量為（11.58±0.83）g/100g。

（2）連續(xù)相變提取法較微波輔助、超聲輔助方法提取效率稍高，且省去過濾、濃縮步驟，生產(chǎn)成本低。由于連續(xù)相變提取裝置的限制（循環(huán)水加熱），提取溫度有一定限度（80～90℃），本試驗(yàn)在提取溫度優(yōu)化方面還有一定不足。

1 謝耀堅(jiān).中國桉樹育種研究進(jìn)展及宏觀策略［J］.世界林業(yè)研究，2011，24（4）：50～54.

2 陳少雄，陳小菲.我國桉樹經(jīng)營的技術(shù)問題與思考［J］.桉樹科技，2013，30（3）：52～59.

3 Chen Yun－jiao，Wang Jun－jiang，Ou Yang－wen，et al.Cellular antioxidant activities of polyphenols isolated from Eucalyptus leaves（Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla GL9）［J］.Journal of Functional Foods，2014，7：737～745.

4 Amakura Y，Umino Y，Tsuji S，et al.Constituents and their antioxidative effects in eucalyptus leaf extract used as a natural food additive［J］.Food Chemistry，2002，77（1）：47～56.

5 Amakura Y，Yoshimura M，Sugimoto N，et al.Marker constituents of the natural antioxidant eucalyptus leaf extract for the evaluation of food additives［J］.Biosci.，Biotechnol.，Biochem.，2009，73（5）：1 060～1 065.

6 Akin M，Aktumsek A，Nostro A.Antibacterial activity and composition of the essential oils of eucalyptus camaldulensis dehn.and myrtus communis L.Growing in northern cyprus［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（4）：531～535.

7 王俊亮.桉葉抗氧化成分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

8 陳洪璋，黃景晟，陳運(yùn)嬌，等.不同月份“廣林9號(hào)”桉葉粗提物總酚含量與抗氧化活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（17）：56～59.

9 王俊亮，肖蘇堯，陳運(yùn)嬌，等.廣林9號(hào)桉葉多酚抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（1）：20～24.

10 肖蘇堯，陳雪香，陳運(yùn)嬌，等.桉葉抗氧化作用研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（14）：396～399.

11 陳亮，李醫(yī)明，陳凱先，等.植物多酚類成分提取分離研究進(jìn)展［J］.中草藥，2013，44（11）：1 501～1 507.

12 Miao Jian－yin，Che Ke，Xi Ru－cun，et al.Characterization and benzo［a］pyrene content analysis of Camellia seed oil extracted by a novel subcritical fluid extraction［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2013，90（10）：1 503～1 508.

13 曹庸.一種多功能連續(xù)相變提取裝置：中國，10306553.5［P］.2014—09—03.

14 Zhao Li－chao，Zhang Yong，He Li－ping，et al.Soysauce residue oil extracted by a novel continuous phase transition extraction under low temperature and its refining process［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（14）：3 230～3 235.

15 周國海，苗建銀，劉飛，等.陳皮揮發(fā)油的低溫連續(xù)相變萃取及特性分析［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（12）：2 931～2 936.

16 湯杰.桉多酚分離提取工藝及其抗氧化活性研究［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.