轉化生長因子β1 抗大鼠肝臟移植排斥反應的作用及機制的實驗研究

張 博，李偉光，吳 波

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普外科，黑龍江 哈爾濱150006

肝臟移植是治療末期肝病有效的方法［1］，同時肝臟移植后的排斥反應影響患者的預后。進行肝臟移植的患者，需伴隨使用免疫抑制劑，以維持受體與移植物之間的平衡關系。目前，有研究［2］發(fā)現，轉化生長因子β1 在移植手術中有抑制Th1 類細胞因子的表達、促進Th2 類細胞因子的表達、誘導免疫耐受的功能?，F將115 只SD 大鼠作為肝臟移植的供體，115 只Wister 大鼠作為肝臟移植的受體，做肝臟移植手術。觀察組腹腔注射轉化生長因子β1，研究其與大鼠肝臟移植排斥反應的關系［3］及機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取8 ～10 周齡雄性大鼠230 只，體質量180 ～200 g，其中115 只為SD 大鼠，作為肝臟移植的供體組，115 只為Wister 大鼠，作為肝臟移植的受體組。將進行肝臟移植的Wister 大鼠隨機分為觀察組和對照組，觀察組腹腔注射轉化生長因子β1，10 ml/d，對照組腹腔注射生理鹽水，10 ml/d。連續(xù)10 d。兩組移植大鼠在周齡、體質量、肝臟移植手術的基本操作及腹腔注射給藥操作等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 建立肝臟移植模型:所有供體和受體大鼠均采用水合氯醛進行麻醉，供體大鼠取腹部十字切口進腹，露出肝門，鈍性分離肝上下腔靜脈、右腎上腺靜脈，后將三條靜脈進行結扎。通過下腔靜脈推注肝素10 ml(130 U/ml)使得供體肝臟肝素化;接著暴露腹主動脈，動脈近端注射乳酸林格液，結扎第一肝門后方的腹主動脈，并剪開肝下下腔靜脈，讓乳酸林格液流出，剪斷肝臟上下腔靜脈;將供體肝臟置于生理鹽水中，備用。受體大鼠肝臟切除，游離出肝臟，用血管夾阻斷門靜脈、上下腔靜脈。從門靜脈側注射生理鹽水，驅走肝臟中血液，然后移除肝臟。將供體肝臟移入受體大鼠內，采用連續(xù)縫合法將上、下腔靜脈進行吻合，然后將供體門靜脈與受體的肝門靜脈進行吻合，松開血管夾，肝臟迅速變紅。觀察腹腔中有無出血，若無，即可將受體的大鼠腹部縫合。

1.2.2 檢測血清中IL-17、IL-12、IL-15、IL-4、IL-10 的表達量:術后分別3 d、7 d、14 d 收集供體大鼠的血液，進行離心，3 500 r/min。血清樣本IL-17、IL-12、IL-15、IL-4、IL-10 的表達量檢測采用ELISA 法進行，儀器使用酶標儀，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 觀察指標 肝臟移植術后記錄兩組大鼠3 d、7 d及14 d 血清中IL-17、IL-12、IL-15、IL-4、IL-10 的表達量，記錄肝臟移植術后兩組大鼠的存活天數。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料比較用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠IL-17 表達量及存活天數比較 兩組大鼠在術后第3 天、第7 天、第14 天的IL-17 表達量比較，對照組均明顯高于觀察組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);對照組存活天數明顯低于觀察組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表1)。

表1 兩組大鼠移植后不同時間點血清中IL-17 表達量及存活天數比較(±s)Tab 1 Comparison of serum levels of IL-17 at different time points and survival days after transplantation between two groups (±s)

表1 兩組大鼠移植后不同時間點血清中IL-17 表達量及存活天數比較(±s)Tab 1 Comparison of serum levels of IL-17 at different time points and survival days after transplantation between two groups (±s)

組別 IL-17 表達量(ng/ml)第3 天 第7 天 第14天 存活天數(d)1.3 ±0.2 1.8 ±0.4 2.4 ±0.7 48.3 ±6.8對照組 2.9 ±0.5 3.8 ±0.7 4.8 ±1.0 27.4 ±2.3 t 值 1.334 2.388 3.234 9.觀察組469 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 兩組大鼠IL-12、IL-15 表達量比較 兩組大鼠在術后第3 天、第7 天、第14 天的IL-12 和IL-15 含量比較，對照組均明顯高于觀察組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表2)。

2.3 兩組大鼠IL-4、IL-10 表達量比較 兩組大鼠在術后第3 天、第7 天、第14 天的IL-4 和IL-10 含量比較，對照組均明顯低于觀察組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表3)。

表2 各組大鼠移植后不同時間點血清中IL-12、IL-15 表達量的比較(ng/ml，±s)Tab 2 Comparison of serum levels of IL-12，IL-15 at different time points after transplantation between two groups (ng/ml，±s)

表2 各組大鼠移植后不同時間點血清中IL-12、IL-15 表達量的比較(ng/ml，±s)Tab 2 Comparison of serum levels of IL-12，IL-15 at different time points after transplantation between two groups (ng/ml，±s)

組別 IL-12表達量第3 天 第7 天 第14天IL-15表達量第3 天 第7 天 第14天7.8 73.2 ±8.2對照組 82.3 ±9.8 97.8 ±11.2 120.6 ±9.6 80.5 ±7.6 91.4 ±10.2 112.0 ±9.7 t 值 8.745 9.228 7.638 8.379 8.561 9.觀察組 70.1 ±6.3 80.2 ±10.4 87.5 ±11.2 67.4 ±5.4 69.1 ±238 P 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 各組大鼠移植后不同時間點血清中IL-4、IL-10 表達量的比較(ng/ml，±s)Tab 3 Comparison of serum levels of IL-4，IL-10 at different time points after transplantation between two groups (ng/ml，±s)

表3 各組大鼠移植后不同時間點血清中IL-4、IL-10 表達量的比較(ng/ml，±s)Tab 3 Comparison of serum levels of IL-4，IL-10 at different time points after transplantation between two groups (ng/ml，±s)

組別 IL-4表達量第3 天 第7 天 第14天IL-10表達量第3 天 第7 天 第14天

3 討論

肝臟移植是治療終末期肝病的有效方法，同時肝臟移植后的排斥反應影響患者的預后。理想的肝臟移植治療效果是在無免疫抑制或低免疫抑制的情況下，抑制移植肝臟的排斥反應仍然能夠發(fā)揮正常功能［4-5］。因此，在器官移植中對抗免疫排斥尤為重要。但長期使用免疫抑制劑，使患者的抵抗力下降，易發(fā)生感染［6］。降低免疫抑制劑的使用量或不使用免疫抑制劑而使受體耐受移植物是臨床抑制免疫學領域的一個研究熱點［7］。轉化生長因子β1 是一種很有潛力的強效免疫抑制因子，本文現研究轉化生長因子β1 抗大鼠肝臟移植排斥反應的作用及機制。

首先建立大鼠肝臟移植模型，在此基礎上研究移植后觀察組每天腹腔注射轉化生長因子β1，10 ml/d，對照組腹腔注射生理鹽水，10 ml/d，連續(xù)10 d 后移植大鼠的急性排斥反應及存活天數。其中急性反應以IL-17 表達量為指標，目的研究轉化生長因子β1 抗大鼠肝臟移植急性排斥反應的作用。結果顯示，觀察組IL-17 表達量明顯低于對照組，大鼠移植肝臟后，存活天數也顯著高于對照組。結果表明，轉化生長因子β1能夠降低肝臟移植大鼠中IL-17 的表達量［8］，IL-17 可能通過高表達各種炎性因子，募集炎癥細胞的作用，造成移植肝臟的損傷、破壞，促進急性排斥反應的發(fā)生。同時，IL-17 在移植免疫反應中起到多種細胞的生物調節(jié)作用，如免疫細胞、炎癥細胞、腫瘤細胞等。本文又分別在移植手術后的第3 天、第7 天及第14 天采集肝臟移植大鼠的血液，分別測定IL-12、IL-15、IL-4、IL-10的表達量，目的在于研究轉化生長因子β1 抗大鼠肝臟移植排斥反應的作用機制。本研究結果表明，轉化生長因子β1 能夠抑制Th1 類細胞因子IL-12、IL-15 的表達量，促進Th2 類細胞因子IL-4、IL-10 的表達量。同時IL-4 也可抑制Th1 類細胞因子的表達量，促進免疫耐受的形成［9］。IL-12 具有免疫調節(jié)作用，在移植免疫過程中參與了移植排斥反應，血清IL-12 能夠預測早期移植物在體內是否發(fā)生排斥反應。IL-10 是一種多功能負性調節(jié)因子，其也參與調節(jié)移植排斥反應，其表達量與移植物存活時間呈正相關調節(jié)作用。

綜上所述，轉化生長因子β1 能夠降低大鼠肝臟移植的急性排斥反應，提高移植大鼠的存活天數，誘導大鼠肝臟移植的免疫耐受［10］。該動物實驗研究證實了轉化生長因子β1 對抗肝臟移植排斥反應的作用及其相關機制，為臨床實踐提供部分理論依據和重要參考。

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