D-IBS 與FD 重疊征大鼠精神狀態(tài)、胃腸激素水平改變

全 俊，嚴 晉，丁 懿，陳 磊，陳齊鳴，朱海杭，張旭東，卜 平

揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院1.消化病研究室;2.病理實驗室，江蘇 揚州225001;3.泰興人民醫(yī)院中醫(yī)科

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是目前最常見的功能性胃腸道疾病之一，據(jù)報道，1/3 ～2/3 IBS 患者具有與功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)相重疊的癥狀［1］。IBS 與FD 重疊的發(fā)病機制尚未完全闡明，普遍認為其與精神心理異常及腦腸軸功能紊亂有關(guān)，癥狀重疊提示兩者可能具有共同的神經(jīng)胃腸病學(xué)基礎(chǔ)［2］。目前對于IBS 重疊FD 大鼠模型胃腸激素水平與行為學(xué)因素關(guān)系的研究鮮有報道。因此，本研究在完成D-IBS 重疊FD 動物模型的基礎(chǔ)上［3］，對D-IBS 重疊FD 模型大鼠神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌失調(diào)機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物:SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，體質(zhì)量(220 ±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)2012-0001。

1.1. 2 藥物:藥物大黃(批號:20120701，產(chǎn)地:甘肅)。大黃煎煮液制備:稱取1 000 g 大黃藥材，粉碎成粉末，加入1 800 ml 水浸泡5 h，煎煮8 min，定容至1 000 ml，即得1 g/ml 的大黃煎煮液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。

1. 1. 3 主要試劑與儀器:5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、生長抑素(somatostatin，SS)、血管活性腸肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)、內(nèi)毒素(endotoxin，ET)及白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗白細胞介素-2(interlenkin-2，IL-2)、免疫組化染色試劑盒及DBA 染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。酶標儀為美國伯樂公司bio-680 型。曠場視頻分析系統(tǒng)(Open-Field 行為學(xué)觀察)購自上海軟隆科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:50 只雄性Wistar 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(A 組)，不處理;造模B 組，采用先FD 后D-IBS 造模法(先夾尾后大黃灌胃，F(xiàn)D +D-IBS);造模C 組，單純FD 造模(單純夾尾造模法);造模D 組，單純D-IBS 造模(單純大黃灌胃法);造模E 組，先D-IBS 后FD 造模法(先大黃灌胃后夾尾造模法，D-IBS+FD);每組10 只，每籠5只。于室溫(22 ±2)℃、相對濕度保持50% ～60%、光照節(jié)律12L∶12D(6∶00 ～18∶00)、噪音＜50 dB 的環(huán)境中飼養(yǎng)，正常攝食飲水。

1.2.2 動物模型的建立:A 組在正常條件下飼養(yǎng)。B組先參考郭氏夾尾刺激法［5］，建立FD 模型，用尖端包裹紗布的大彎止血鉗夾大鼠尾巴遠端1/3 處，大鼠暴怒，令其與其他大鼠撕打，間接激怒全籠大鼠，每次刺激30 min，30 min 內(nèi)連續(xù)不斷地刺激，3 次/d，以不破皮流血為度，持續(xù)刺激7 d。大鼠受傷后用聚維酮碘消毒液涂擦損傷部位預(yù)防感染干擾實驗結(jié)果。造模第8天，開始用大黃煎煮液(1 g/ml)灌胃，2 ml/只，2 次/d，連續(xù)灌胃14 d，建立D-IBS 模型［4］。灌胃時繼續(xù)夾尾刺激，頻次改為2 次/d，每次15 min。C 組夾尾刺激法14 d，D 組大黃煎煮液灌胃14 d，E 組先大黃煎煮液(1 g/ml)灌胃7 d，第8 天在灌胃的同時，進行夾尾刺激，每次刺激30 min，3 次/d，持續(xù)刺激7 d。

1.2.3 實驗方法:造模結(jié)束，禁食禁水24 h，2%葡聚糖藍2 000 溶液0.4 ml/只灌胃，30 min 后5%水合氯醛腹腔麻醉。開腹肝門靜脈取血裝于乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetie acid-K2，EDTA-K2)抗凝管中，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑11 cm，取血漿分裝后于-80 ℃冰箱凍存待測。并取胃和結(jié)腸。

1.2.4 進食量的測定:采用進食量差值測定法。每組動物每日上午8∶00 給定量的大鼠飼料，至次日上午8∶00測量剩余量，兩者的差值與大鼠數(shù)目的比值，即為每只大鼠的每日進食量。

1.2.5 糖水消耗實驗:采用糖水消耗百分比測定法。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間訓(xùn)練大鼠喝糖水，第1 天給予兩瓶1%(1 g/100 ml)的蔗糖水溶液，第2 天開始每籠左右次序隨機的糖水、蒸餾水各一瓶，直至造模前1 d(下午2∶00)開始每7 d 進行一次糖水消耗實驗，評估大鼠對獎勵的敏感性。測糖水消耗前1 d 禁食禁水21 h 后每籠給予每組大鼠1 瓶1%(1 g/100 ml)的蔗糖水溶液和1 瓶蒸餾水，然后測定各組大鼠在120 min 后的蔗糖水溶液和蒸餾水的飲用量，計算糖水消耗百分比率。糖水消耗實驗是客觀觀察大鼠對于獎賞的反應(yīng)，糖水消耗百分比降低提示大鼠對幸福事件反映能力降低，這是一種特異性的快感缺乏，代表大鼠的抑郁精神狀態(tài)。

1.2.6 大鼠胃排空測定:大鼠取血和組織后，自幽門括約肌處取胃，沿大彎側(cè)剪開，將胃內(nèi)殘留色素充分溶于10 ml 蒸餾水中，超聲15 min，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，620 nm 測吸光度，求出與A 組均值的百分比，即胃內(nèi)色素相對殘留率，相對殘留率越低，胃排空越強。

1.2. 7 曠場實驗:實驗用長× 寬× 高為50 cm ×50 cm×40 cm 的曠場箱，內(nèi)側(cè)壁及底面為黑色，曠場箱正上方安置攝像頭。參考文獻［6］，于造模前1 d 及造模后，在安靜無干擾并杜絕參照物的環(huán)境條件下進行。實驗前先將大鼠置于測試室內(nèi)適應(yīng)10 min。握住大鼠尾根部1/3 處，輕輕將大鼠放入曠場箱的正中，開始同步錄像、計時。觀察3 min 內(nèi)大鼠活動情況，進行行為學(xué)分析。曠場實驗可以客觀評價大鼠行為學(xué)變化，平均速度的減少反映大鼠處于焦慮狀態(tài)［7］。參照文獻［8］，曠場實驗可以客觀評價大鼠行為學(xué)變化，平均速度的減少反映大鼠處于焦慮狀態(tài)。

1.2.8 血液及腸組織相關(guān)指標檢測:取-80 ℃保存的血漿復(fù)融后，混勻，3 000 r/min 離心15 min，取上清液測定。采用ELISA 法檢測，并按照說明書要求嚴格操作測定血漿5-HT、SS、VIP、ET 及IL-10。采用DAB免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠腸組織中IL-2 表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件及EXCEL 軟件進行處理，描述性資料用±s 表示，組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的行為學(xué)觀察 整個造模過程中，A 組大鼠的一般外觀行為等無異常。與A 組相比，隨著造模天數(shù)的增加，模型組(B、C、D、E)大鼠的行為狀態(tài)均由正常逐漸變得少動、扎堆、弓背、不活躍;背毛由順滑、光澤變得枯黃、蓬亂、沒有光澤;睡眠逐漸變得易醒、倦臥;B 組情緒由正常變得易怒，繼而淡漠，對外界刺激興奮性低，C 組情緒由正常變得易怒，D、E 組情緒由正常變得淡漠，對外界刺激興奮性低;B、D、E 均出現(xiàn)大便不成形;在造模的第2 天大鼠進食量減少，第3 天大鼠體質(zhì)量增長減緩。造模14 d 后各模型組大鼠體質(zhì)量增長顯著下降(P ＜0.01，見表1)。

表1 5 組大鼠體質(zhì)量及日均進食量比較(g，±s)Tab 1 Comparison of the average daily food intake and quality of 5 groups rats (g，±s)

表1 5 組大鼠體質(zhì)量及日均進食量比較(g，±s)Tab 1 Comparison of the average daily food intake and quality of 5 groups rats (g，±s)

注:與A 組比較，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05。

分組 例數(shù) 體質(zhì)量增長 日均進食量A 組10 73.1 ±7.9 31.5 ±0.7 B 組 10 35.3 ±9.5＊＊ 20.3 ±1.1*C 組 10 45.0 ±6.1＊＊ 23.1 ±1.6*D 組 10 3.9 ±12.4＊＊ 19.8 ±0.5*E 組 10 -2.5 ±12.1＊＊ 19.5 ±0.5*

2.2 大鼠胃排空的測定 與A 組(100.0 ±13.1)%比較，B 組(144.1 ±17.2)%、C 組(168.0 ±20.0)%大鼠胃內(nèi)色素相對殘留率顯著增大(P ＜0. 05)，D 組(39.0 ±12.4)%顯著降低(P ＜0.01)，E 組(105.3 ±12.3)%變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 大鼠解剖結(jié)構(gòu)的觀察 解剖各組大鼠后肉眼觀察胃及腸組織，未見潰瘍及色澤形態(tài)改變。造模后B組大鼠體質(zhì)量增長幅度顯著下降、進食量顯著減少，且造模過程中一直有稀便;肉眼觀察胃腸解剖結(jié)構(gòu)未見異常。與文獻［3］描述相一致，說明B 組D-IBS 與FD重疊征模型建立成功，剔除E 組。

2.4 造模對大鼠糖水消耗的影響 與A 組(83.4 ±13.6)%比較，B 組(63. 4 ± 9. 3)% 顯著降低(P ＞0.01)，C 組(74.4 ±7.5)%大鼠糖水消耗百分比顯著降低(P ＜0.05)，D 組(78.2 ±5.3)%差異變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.5 大鼠曠場內(nèi)平均速度 與A 組(1.49 ±0.28)%比較，B 組(1.09 ±0.22)%、E 組(0.82 ±0.21)%大鼠曠場內(nèi)平均活動速度顯著降低(P ＜0. 05)，C 組(1.53 ±0.40)%變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.6 大鼠血漿中腦腸肽、細胞因子測定 與A 組比較，B 組大鼠血漿5-HT 水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0. 05);C 組大鼠血漿IL-10 水平顯著升高(P ＜0.01);與A 組、B 組比較，D 組大鼠血漿ET 水平顯著降低(P ＜0.05);B 組、D 組大鼠血漿SS 水平顯著降低(P ＜0. 01);B、D 組大鼠VIP 水平顯著升高(P ＜0.01，見表2)。

表2 大鼠血漿中腦腸肽、細胞因子檢測結(jié)果(±s)Tab 2 Detection results of ghrelin and cytokines in the rats plasma (±s)

表2 大鼠血漿中腦腸肽、細胞因子檢測結(jié)果(±s)Tab 2 Detection results of ghrelin and cytokines in the rats plasma (±s)

注:與A 組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。與B 組比較，△P ＜0.05。

分組 例數(shù) 5-HT(pg/ml) IL-10(ng/L) ET(Eu/L) SS(μg/L) VIP(ng/L)A 組 10 145.92 ±21.03 42.31 ±6.16 0.58 ±0.09 10.75 ±0.59 284.40 ±37.37 B 組 10 136.66 ±28.81 43.71 ±4.16 0.65 ±0.13 8.40 ±2.53＊＊ 406.87 ±67.15＊＊C 組 10 149.51 ±34.40 53.90 ±7.68＊＊ 0.59 ±0.13 9.74 ±1.01 314.46 ±63.46 D 組 10 153.23 ±27.57 45.35 ±5.50 0.47 ±0.03＊△ 6.33 ±1.46＊＊ 439.23 ±52.65＊＊

2.7 大鼠結(jié)腸組織IL-2 陽性細胞百分比測定 與A組比較，模型組結(jié)腸組織IL-2 主要表達在胞質(zhì)內(nèi)(見圖1)。與A 組IL-2 陽性細胞(54.9 ±8.3)%比較，C組(43.7 ±4.1)%、D 組(45.4 ±5.2)%顯著減少(P ＜0.01);B 組(54.0 ±7.5)%變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 大鼠結(jié)腸組織IL-2 陽性細胞百分比(400 ×) A:A 組;B:B 組;C:C 組;D:D 組Fig 1 IL-2 positive cell percentage of colonic tissue in rats A:A group;B:B group;C:C group;D:D group

3 討論

IBS 特別是腹瀉型IBS 與FD 是兩種臨床常見性胃腸病。IBS 和FD 臨床上易發(fā)生重疊，內(nèi)臟高敏感性及胃腸動力功能失調(diào)可能是其共同的發(fā)病機制，此外還包括社會心理等影響。代子艷等［8］研究發(fā)現(xiàn)，IBS重疊FD 患者比單純IBS 或FD 患者合并焦慮、抑郁的比例更高，胃腸道癥狀更嚴重。本研究采用“夾尾刺激+大黃灌胃”方法構(gòu)建D-IBS 與FD 重疊大鼠模型，與A 組比較，造模后大鼠出現(xiàn)弓背、背毛枯黃、稀大便、易怒等癥狀，測體質(zhì)量增長顯著降低，胃排空延遲明顯，與D-IBS 與FD 重疊患者腹痛、腹瀉、精神異常、胃排空延遲相一致。

本研究中，與A 組比較，B 組、C 組大鼠糖水消耗百分比顯著降低，D 組無明顯變化，推測D-IBS 與FD重疊造模大鼠較單純D-IBS 及FD 造模大鼠更為抑郁。大鼠曠場實驗，已被廣泛用于神經(jīng)學(xué)與精神藥理學(xué)研究中［7］。本研究中，與A 組比較，B、D 組大鼠曠場內(nèi)平均速度顯著下降，而C 組無明顯變化，說明重疊征造模大鼠及單純D-IBS 造模大鼠活躍度下降。結(jié)合糖水消耗實驗結(jié)果推測D-IBS 與FD 重疊造模大鼠精神癥狀更為嚴重。

首先，5-HT 作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦，參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)，與胃腸道活動關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，在注射相同劑量5-HT 時，傷害感受，表明外周5-HT 水平與內(nèi)臟高敏感性有密切關(guān)系［9］。5-HT 是一種能產(chǎn)生愉悅情緒的信使，5-HT 水平較低的人群更容易發(fā)生抑郁、沖動、酗酒、自殺、攻擊及暴力行為。本身為一類抗抑郁藥［10］，可減少患者對酒的渴求程度，減少飲酒量［11］。本研究中，與A 組比較，D 組大鼠血漿中5-HT 水平有升高趨勢;B 組大鼠有降低趨勢。考慮本研究中D-IBS 與FD重疊造模組大鼠同時存在抑郁和腸道高敏感這兩種導(dǎo)致5-HT 水平相反的狀態(tài)，故大鼠血漿中5-HT 水平無統(tǒng)計學(xué)意義。

其次，SS 廣泛存在于胃腸道黏膜的D 細胞，以胃竇和胃體最高，在腸內(nèi)越往下含量越低。SS 通過旁分泌機制由突起釋放到G 細胞和壁細胞膜上，抑制胃泌素和HCl 分泌，在胰腺內(nèi)，SS 由胰島D 細胞分泌，通過血液循環(huán)對胃腸運動與消化道激素的分泌產(chǎn)生抑制作用。SS 水平降低可導(dǎo)致胃泌素分泌過多及胃腸蠕動增強;胃泌素促進胃竇、胃體收縮，增加胃腸道的運動，同時促進幽門括約肌收縮;整體綜合作用是使胃排空減慢［12］。本研究中，與A 組比較，D-IBS 與FD 重疊造模組大鼠血SS 顯著降低，推測D-IBS 與FD 重疊造模組大鼠胃排空延遲及腸蠕動增強與血漿SS 水平降低有關(guān)。

再次，VIP 是神經(jīng)遞質(zhì)的一種，存在于中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中。食管下括約肌的舒張則是由迷走神經(jīng)纖維末梢釋放的VIP 介導(dǎo)的，VIP 又通過促進靶細胞合成NO 而使平滑肌舒張。對腸液的分泌具有很強的促進作用，對胃液的分泌可起抑制作用，對消化道平滑肌的收縮產(chǎn)生抑制作用［13］。本研究中，與A 組比較，具有腹瀉癥狀的B、D 組血漿VIP 水平顯著升高，推測D-IBS 與FD 重疊造模組大鼠腹瀉癥狀與血漿VIP 水平升高有關(guān)。

此外，ET 是革蘭氏陰性菌菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱，是多種革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，由菌體裂解后釋出。腸道菌群多為革蘭氏陰性菌，如乳酸桿菌，當與宿主處于生態(tài)平衡狀態(tài)，它們并不引起機體的感染，但是，在特定條件下，因為菌群失調(diào)、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改變造成了生態(tài)失調(diào)狀態(tài)，正常菌群也能引起感染。大腸桿菌產(chǎn)生分泌到它們細胞外面的腸毒素能引起患者腹瀉［14］;造模用大黃具有廣譜抗菌作用［15］，故與A 組比較，較單純大黃灌胃的D 組大鼠血漿ET 水平顯著降低，而與D 組比較，“夾尾刺激+大黃灌胃”的B 組大鼠血漿內(nèi)ET 水平顯著升高，推測D-IBS 與FD 重疊造模組大鼠存在腸道菌群紊亂，釋放ET 導(dǎo)致腹瀉癥狀。

最后，IL-10 是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調(diào)節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子。有很多觀察描述了IL-10 在各種疾病的發(fā)病機理中有很重要的作用，并分為兩個亞型:IL-10 表達過多疾病，IL-10 表達絕對或相對減少引起疾病，IL-10 表達過多會引起免疫抑制作用［16］。本研究中，與A 組比較，D 組大鼠血漿IL-10水平顯著升高，B 組變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測FD大鼠免疫力下降，重疊征模型大鼠免疫力正常。

IL-2 是白細胞介素中的一種。它由多細胞來源(主要由活化T 細胞產(chǎn)生)，又具有多向性作用的細胞因子(主要促進淋巴細胞生長、增殖、分化)。它對機體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染等有重要作用，可提高人體對病毒、細菌、真菌、原蟲等感染的免疫應(yīng)答，使細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)、天然殺傷細胞(NK)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)增殖，并使其殺傷活性增強，進而清除體內(nèi)腫瘤細胞和病毒感染細胞等［17］。IL-2 水平降低與年齡的增長及免疫缺陷病有關(guān)。本研究中，與A 組比較，C、D組大鼠腸組織中IL-2 表達陽性細胞顯著減少，B 組大鼠腸組織中IL-2 表達陽性細胞數(shù)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測單純FD 與單純D-IBS 模型大鼠存在免疫應(yīng)答和抗病毒感染能力下降，D-IBS 與FD 重疊造模組大鼠無免疫應(yīng)答和抗病毒感染能力變化。

本研究通過建立D-IBS 與FD 重疊征大鼠模型，觀察大鼠抑郁程度、活躍度，測定大鼠血漿和組織中神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫相關(guān)腦腸肽細胞因子水平變化。研究發(fā)現(xiàn)，較正常對照組及單純D-IBS 和單純FD 造模組比較，D-IBS 與FD 重疊征大鼠模型更為抑郁、活躍度更低、生長抑素降低、血管活性腸肽水平升高、血漿內(nèi)毒素水平升高，免疫功能無明顯異常。

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