應(yīng)用SNaPshot 單堿基延伸反應(yīng)方法檢測(cè)多個(gè)目的基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病易感性的關(guān)系

李裕碧，周永健，李瑜元，聶玉強(qiáng)，杜艷蕾

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510180

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種很常見(jiàn)的導(dǎo)致肝臟脂肪變性的疾病，廣東省的發(fā)病率達(dá)到14%左右［1-2］。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全清晰。國(guó)外有較多的研究表明單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與NAFLD 關(guān)系密切［3］，國(guó)內(nèi)的研究多以單個(gè)位點(diǎn)較多，并且鮮有涉及基因型與NAFLD 嚴(yán)重程度相關(guān)研究。胰島素抵抗及代謝綜合征與NAFLD 密切相關(guān)，因此本研究選取NAFLD 發(fā)病通路中影響胰島素抵抗和代謝綜合征的9 個(gè)基因位點(diǎn)。用SNaPshot 單堿基延伸反應(yīng)同時(shí)測(cè)定9 個(gè)位點(diǎn)基因型，初步探討其在廣東漢族人群中與NAFLD 嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010 年廣州市社區(qū)流調(diào)人群共194 人，確診NAFLD 102 例(男/女= 24/78)，為NAFLD 組，健康人群92 名(男/女=28/64)，為對(duì)照組。NAFLD 診斷標(biāo)準(zhǔn)采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010 年修訂的非酒精性脂肪性肝病診療指南［4］。所有病例無(wú)飲酒史，排除病毒性肝炎、藥物性肝病、Wilson 病等可導(dǎo)致脂肪肝的特定疾病。B 超診斷NAFLD 參考2008 NAFLD 的診斷和治療指南標(biāo)準(zhǔn)［5］。選取的9 個(gè)位點(diǎn)均在dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)漢族人群中的最小等位基因頻率(MAF)＞0.1。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和保存:采集清晨空腹靜脈血4 ml，其中2 ml 交由檢驗(yàn)科檢測(cè)血糖、胰島素、肝三酶、血脂四項(xiàng)。其余2 ml 保存于-80 ℃超低溫冰箱中，統(tǒng)一時(shí)間提取DNA 后待下一步分析。

1.2.2 SNP 分型:采用SNaPshot 分型技術(shù)平臺(tái)測(cè)定基因型。具體步驟如下:(1)測(cè)定DNA 濃度(采用美國(guó)NanoDrop 公司ND-1000 分光光度計(jì)):根據(jù)測(cè)定的濃度將樣本稀釋到工作濃度5 ～10 ng/μl。(2)PCR擴(kuò)增:采用touchdown 反應(yīng)模式，引物用在線Primer3軟件設(shè)計(jì)，上海生工公司(廣州)合成。a:PCR 引物見(jiàn)表1;b:擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系(10 μl)包含1 × GC-I buffer (Takara.)，3. 0 mmol/L Mg2+，0. 3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA 和1 μl 多重PCR 引物。其中每條引物的終濃度為1 μmol/L;c:擴(kuò)增參數(shù)，第一步95 ℃，2 min。第二步11 ×(94 ℃20 s，65 ℃40 s，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃，72 ℃1.5 min)。第三步24 ×(94 ℃20 s，59 ℃30 s，72 ℃1.5 min)。第四步72 ℃2 min 4 ℃結(jié)束。(3)產(chǎn)物純化:在10 μl PCR 產(chǎn)物中加入1 U SAP 酶和1 U Exonuclease I 酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min。(4)SNaPshot 單堿基延伸反應(yīng):a:延伸引物見(jiàn)表1;b:延伸反應(yīng)體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μl 純化后多重PCR 產(chǎn)物，1 μl 延伸引物混合物(各引物的終濃度為 0. 8 μmol/L，其中rs10865710SR 為0.4 μmol/L)，2 μl 超純水;c:延伸熱循環(huán)程序:96 ℃1 min;28 × (96 ℃10 s，52 ℃5 s，60 ℃30 s);4 ℃結(jié)束。(5)延伸產(chǎn)物純化，在10 μl延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP 酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min。(6)延伸產(chǎn)物上ABI 3500 測(cè)序儀:取0.5 μl純化后的延伸產(chǎn)物，與0. 5 μl Liz120 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min 后，立即置于冰上，2 min 后上ABI 3500 測(cè)序儀(ABI，USA)分析。(7)數(shù)據(jù)記錄及分析:在ABI 3500 測(cè)序儀上用3500 Series Software 2 軟件(ABI，USA)記錄原始數(shù)據(jù)，用GeneMapper 5.0 軟件(ABI，USA)分析。由于在最后一步PCR 反應(yīng)中加有4 種不同顏色熒光標(biāo)記的dNTP，分別代表A/G/C/T 堿基，反應(yīng)產(chǎn)物只在引物延生一個(gè)堿基，延伸的堿基就是該樣本在該位點(diǎn)上的基因型，當(dāng)在ABI 3500 測(cè)序儀上檢測(cè)時(shí)，可以檢測(cè)是哪種顏色熒光，從而判斷堿基的類(lèi)型。用GeneMapper 5.0軟件可以得到樣本的基因型。

表1 PCR 引物和延伸引物Tab 1 PCR primers and extension primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有組別進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)確定樣本群體的代表性。連續(xù)型變量采用±s 表示，計(jì)數(shù)資料直接給出具體數(shù)值?；蝾l率采用直接計(jì)數(shù)法。兩組定量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差齊性用兩樣本獨(dú)立t 檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)分布但方差不齊用校正t 檢驗(yàn)，即t'檢驗(yàn)，不滿(mǎn)足正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的秩和檢驗(yàn)。兩樣本以上的定量資料比較用方差分析，兩兩比較用Bonferroni 檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 16.0 進(jìn)行分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 堿基類(lèi)型的判別 根據(jù)堿基顏色判斷堿基類(lèi)型，其中純合子表現(xiàn)為單峰，雜合子表現(xiàn)為雙峰(見(jiàn)圖1)。

圖1 SNaPshot 單堿基延伸反應(yīng)方法檢測(cè)結(jié)果Fig 1 Results of the genotypes by SNaPshot single nucleotide extension reaction method

2.2 NAFLD 組和對(duì)照組一般臨床資料及生化指標(biāo)的比較 結(jié)果顯示兩組的性別及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＞0.05)。NAFLD 組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)明顯較對(duì)照組大(P ＜0.001)，腰臀比(WHR)兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.001)。胰島素抵抗(HOMA-IR)指數(shù)NAFLD 組大于對(duì)照組(P ＜0.001)。肝臟酶學(xué)指標(biāo)(ALT、AST、γ-GT)，NAFLD 組均較正常組升高(P均＜0.001)。脂質(zhì)四項(xiàng)中除HDLC 在NAFLD 組是降低，其余三項(xiàng)(TC、TG、LDLC)均升高(P 均＜0.05，見(jiàn)表2)。

2.3 NAFLD 患者輕度、中度及重度組一般臨床資料及生化指標(biāo)的比較 NAFLD 組按照B 超檢查結(jié)果分成輕度(58 例)、中度(32 例)和重度(12 例)。三組年齡及γ-GT 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.071、0.32)。NAFLD 程度越高，其BMI 指數(shù)及LDLC 含量也增高(P 均＜0.05)。腰臀比在中重度要明顯大于輕度(P ＜0.001)。HOMA-IR 指數(shù)輕中度要小于重度(P ＜0.001)。隨著NAFLD 程度增加，轉(zhuǎn)氨酶ALT 及AST 均升高(P 均＜0.005)，γ-GT 雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.32)。TG 含量在重度明顯較輕中度均高(P ＜0.001)，而HDLC 則是降低趨勢(shì)(P ＜0.001)，TC 則顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見(jiàn)表3)。

表2 NAFLD 組和對(duì)照組臨床資料和生化指標(biāo)的比較Tab 2 Comparison of clinical and biochemical indicators between NAFLD and control groups

表3 NAFLD 組輕度、中度及重度在一般臨床資料和生化指標(biāo)的比較(±s)Tab 3 Comparison of clinical and biochemical indicators among mild，moderate and severe groups of NAFLD (±s)

表3 NAFLD 組輕度、中度及重度在一般臨床資料和生化指標(biāo)的比較(±s)Tab 3 Comparison of clinical and biochemical indicators among mild，moderate and severe groups of NAFLD (±s)

注:數(shù)值后面的字母相同表示兩兩比較P ＞0.0017(0.05/3)，字母不相同表示兩兩比較，P ＜0.0017。

輕度 中度 重度 P值57.57 ±11.16 57.53 ±12.58 56.83 ±15.38 0.071 BMI(kg/m2) 25.61 ±5.30a 27.36 ±2.23b 27.87 ±3.54c 0.000 WHR 0.90 ±0.05a 0.92 ±0.06b 0.93 ±0.06b 0.000 HOMA-IR 8.03 ±3.39a 6.46 ±3.14a 3.15 ±7.39b 0.010 AST(U/L) 27.87 ±13.24a 29.40 ±11.91a 33.50 ±18.93b 0.001 ALT(U/L) 29.74 ±17.66a 30.95 ±30.71a 41.33 ±13.85b 0.002 γ-GT(U/L) 32.77 ±21.63 34.65 ±16.46 36.78 ±21.34 0.320 TG(mmol/L) 2.65 ±2.16a 3.09 ±3.14a 3.14 ±1.67b 0.000 TC(mmol/L) 5.00 ±0.75 5.16 ±1.07 5.30 ±1.26 0.060 HDLC(mmol/L) 1.48 ±0.49a 1.32 ±0.46a 1.24 ±0.49b 0.000 LDLC(mmol/L) 2.03 ±0.90a 2.24 ±0.92b 2.92 ±1.24c年齡(歲)0.030

2.4 NAFLD 組和對(duì)照組的基因型頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 除TNFα 基因rs361525 位點(diǎn)外，其他基因位點(diǎn)在兩組基因頻數(shù)分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0. 05)。PPARγ 基因rs10865710 位點(diǎn)C 等位基因、ADIPOQ 基因rs1501299 位點(diǎn)T 等位基因、FDFT1 基因rs2645424位點(diǎn)G 等位基因、AGTR1 基因rs3772622 位點(diǎn)G 等位基因、MTTP 基因rs3816873 位點(diǎn)T 等位基因、PNPLA3基因rs738409 位點(diǎn)C 等位基因、ADIPOR2 基因rs767870 位點(diǎn)A 等位基因、PEMT 基因rs7946 位點(diǎn)C等位基因在NAFLD 組中頻數(shù)高于對(duì)照組(P 均＜0.05，見(jiàn)表4)。

表4 NAFLD 組和對(duì)照組基因型頻數(shù)的比較Tab 4 Comparison of genotype frequency between NAFLD group and control group

2.5 NAFLD 患者輕度、中度和重度組的基因型頻率的比較 進(jìn)一步按照輕、中、重度分組。PNPLA3 基因rs738409 位點(diǎn)C 等位基因在輕、中、重度的頻數(shù)分別為0.39、0.59 和0.83(P=0.002)，其余位點(diǎn)則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見(jiàn)表5)。

表5 NAFLD 患者輕度、中度和重度組各基因型頻率的比較Tab 5 Comparison of genotype frequency among mild，moderate and severe groups of NAFLD

3 討論

NAFLD 包含一系列的肝臟疾病譜，從單純性脂肪肝(肝細(xì)胞甘油三酯的含量累積超過(guò)5%)到脂肪性肝炎(肝細(xì)胞炎癥和氣球樣變性)、肝纖維化，最終肝硬化［3］。目前認(rèn)為遺傳因素在NAFLD 的發(fā)病中有重要作用，其中與基因多態(tài)性關(guān)系密切［6］。SNP 是遺傳因素中的重要組成部分，其序列上的變異，與人體對(duì)疾病的易感性及抵抗力有關(guān)，甚至可以影響臨床表現(xiàn)及治療的反應(yīng)［3，7］。理論上，NAFLD 發(fā)病過(guò)程相關(guān)基因非常多，目前不可能同時(shí)將所有的基因及其位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行候選基因SNP 研究。因此，本研究選擇了9 個(gè)與NAFLD 的發(fā)病密切相關(guān)基因位點(diǎn)。

檢測(cè)這些基因多態(tài)性的方法有許多種，比如測(cè)序分析方法，但是其成本高，通量低，檢測(cè)周期較長(zhǎng);及核酸電泳法，其對(duì)樣本要求高;還有TaqMan 探針?lè)?，其?duì)探針設(shè)計(jì)較復(fù)雜，設(shè)計(jì)周期長(zhǎng)。我們利用SNaPshot分型技術(shù)平臺(tái)測(cè)定以上基因型，該方法有以下優(yōu)點(diǎn)，首先引物和探針合成周期短，1 周之內(nèi)可以合成完畢。其次可以做多重的SNP 檢測(cè)，降低了成本。最后樣本數(shù)量要求不高，100 ～1 000 的樣本量都很適合并且位點(diǎn)成功率和準(zhǔn)確率均＞95%。

上述基因位點(diǎn)對(duì)NAFLD 影響的側(cè)重點(diǎn)不同，可大致分為三類(lèi)。

PPARγ、ADIPO、ADIPOR2 與胰島素敏感性相關(guān):一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)漢族人群的研究結(jié)果［8］表明PPARγ 基因rs10865710 位點(diǎn)多態(tài)性的劣勢(shì)基因與肥胖關(guān)系密切。本研究則顯示G 等位基因頻率在NAFLD 人群中(39.2%)較正常人群高(37.5%，P =0.03)，提示G等位基因可能增加NAFLD 易感性。與前人研究結(jié)果類(lèi)似。日本的一項(xiàng)研究［9］表明ADIPO 基因rs1501299位點(diǎn)GG 型的個(gè)體發(fā)生胰島素抵抗明顯高于其他基因型的個(gè)體。而在本研究中則相反，攜帶T 型等位基因的個(gè)體發(fā)生NAFLD 的比例高于G 等位基因。推測(cè)其結(jié)果不同可能與研究種族有關(guān)。有報(bào)道ADIPOR2 基因rs767870 位點(diǎn)在調(diào)整年齡、性別及BMI 后，其次要等位基因即G 等位基因與肝臟脂肪含量減少有關(guān)［10］。本研究結(jié)果與前人研究基本相同，顯示G 等位基因在NAFLD 中的頻率較低。

FTFD1、TNFα、AGTR1、PNPLA3 參與氧化活性代謝和細(xì)胞因子通路:國(guó)外一項(xiàng)全基因組掃描研究(GWAS)［11］表明FTFD1 基因rs2645424 位點(diǎn)與病理活檢確診的NAFLD 活動(dòng)評(píng)分有關(guān)，本研究則進(jìn)一步證實(shí)其G 等位基因與NAFLD 易感性增加有關(guān)。較早的的一項(xiàng)研究［12］指出，TNFα 基因rs361525 位點(diǎn)G 等位基因通過(guò)增加血清中TNFα 含量參與胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝，從而與NAFLD 發(fā)生有一定關(guān)系，但在本實(shí)驗(yàn)中則未能發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。一項(xiàng)多民族的基因易感性分析指出rs3772622 位點(diǎn)，G 等位基因與NAFLD 纖維化的發(fā)生有關(guān)［13］，本研究同樣支持NAFLD 患者組中G等位基因占主導(dǎo)。國(guó)內(nèi)的研究指出攜帶G 等位基因的個(gè)體患NAFLD 的易感性更高［14］。本研究結(jié)果顯示G 等位基因個(gè)體患NAFLD 易感性高于C 等位基因，結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致，并且在NAFLD 重度患者中G 等位基因的頻數(shù)也較高，這可以解釋GG 型更易患NASH 及纖維化。

PEMT、MTTP 與肝臟脂肪代謝相關(guān):rs7946 等位基因多態(tài)性可能會(huì)導(dǎo)致血清PEMT 含量下降，并增加NAFLD 易感性［15］。本研究進(jìn)一步證實(shí)C 型等位基因，其N(xiāo)AFLD 易感性增加。既往研究顯示MTTP 基因rs3816873(I128T)多態(tài)性位點(diǎn)錯(cuò)義突變，即編碼區(qū)128位點(diǎn)異亮氨酸Ile 變?yōu)樘K氨酸Thr，導(dǎo)致MTTP 的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，熱穩(wěn)定性下降，容易被水解以及與載脂蛋白B 的結(jié)合降低，影響脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能［16］。在本研究中MTTP 基因位點(diǎn)(rs3816873)G 等位基因在NFALD 組中的頻率高于其他基因型，與前人研究一致。

既然在NAFLD 組和對(duì)照組中其優(yōu)勢(shì)等位基因不同，那么在不同程度的NAFLD 患者中是否仍有此現(xiàn)象呢?當(dāng)我們把NAFLD 患者按照B 超結(jié)果分成輕、中及重度組，并且將各個(gè)位點(diǎn)基因型頻率結(jié)合起來(lái)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有PNPLA3 基因rs738409 位點(diǎn)在三組的分布有差異，并且G 等位基因在重度的NAFLD 中頻率較高，提示攜帶此位點(diǎn)個(gè)體NASH 或纖維化的易感性高于C 等位基因。

本研究存在一定局限性，首先，病理組織學(xué)診斷為NAFLD 診斷金標(biāo)準(zhǔn)，本文采用B 超代替，不如前者有說(shuō)服力;其次，基因位點(diǎn)的選擇比較分散，位點(diǎn)數(shù)量較少;最后，樣本量偏少可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有影響，需要更大樣本含量及多中心的研究來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示除TNFα 位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)均在NAFLD 組中發(fā)現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)等位基因。提示攜帶上述等位基因的個(gè)體其N(xiāo)AFLD 的易感性也增高。PNPLA3 基因rs738409 位點(diǎn)與G 等位基因增加NAFLD 易感性，并且其與NAFLD 嚴(yán)重程度相關(guān)。

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