血卟啉單甲醚介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)裸鼠人食管癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究

郭 哲，王瑞峰，孟憲紅，周 婷，韓繼武

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱150001

食管癌指食管上皮組織異常增生形成的一種惡性腫瘤，是目前我國(guó)以至世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，且近些年逐漸呈高發(fā)趨勢(shì)，早期食管癌手術(shù)切除療效好，但多半患者確診時(shí)已發(fā)展至癌癥中期甚至晚期，早已失去手術(shù)治愈的可能，只能采用放、化療治療，這兩種方法在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，還會(huì)引起正常組織細(xì)胞的損傷，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，很多患者不能耐受。近年來隨著內(nèi)鏡介入治療的發(fā)展，光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)越來越多地被用于胃腸道腫瘤的治療中，血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)作為一種新型的光敏劑被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)研究。HMME 是第二代卟啉光動(dòng)力治療藥物，具有價(jià)格低廉、體內(nèi)迅速代謝、結(jié)構(gòu)明確、光敏效應(yīng)強(qiáng)、腫瘤攝入率高、靶向性強(qiáng)、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。由于PDT 的多樣性及光敏劑種類的不同，于臨床實(shí)踐中，血卟啉單甲醚介導(dǎo)的光動(dòng)力治療(HMME-PDT)對(duì)于食管癌治療的具體效果暫不明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究HMME-PDT 對(duì)裸鼠人食管癌種植瘤的作用，為臨床HMME-PDT 治療人腫瘤細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌ECA-109 細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)中心細(xì)胞庫(kù)提供;HMME 為凍干粉劑，購(gòu)自上海先鋒醫(yī)藥有限公司，SPF 級(jí)裸小鼠，4 ～6 周齡，體質(zhì)量16 ～18 g，雄雌兼用，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物養(yǎng)殖中心;CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī)、生物倒置顯微鏡等均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供;半導(dǎo)體激光器(630 nm)由哈爾濱工業(yè)大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2. 1 細(xì)胞培養(yǎng):人食管癌ECA-109 細(xì)胞株，于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，用含EDTA 的0.25%胰酶常規(guī)消化傳代，每3 d 傳代1 次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%，取進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 裸小鼠人食管癌移植瘤模型的建立:收集經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ECA-109 人食管癌細(xì)胞，并采用臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，保證活細(xì)胞率＞99%，無血清HMME 培養(yǎng)液離心洗滌3 次，去除培養(yǎng)液中的血清。并以無血清HMME 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至109個(gè)/ml，在超凈工作臺(tái)內(nèi)按照無菌手術(shù)原則操作，將裸小鼠四肢固定后，種植部位均選裸鼠右側(cè)腋窩上部，局部消毒后，4#針經(jīng)皮穿刺，于皮下緩慢注入ECA-109 細(xì)胞懸液0.2 ml(含細(xì)胞約1 ×108個(gè))，術(shù)后繼續(xù)在SPF 級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每3 d 用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，當(dāng)腫瘤直徑長(zhǎng)至0.6 ～0.8 cm，體積0.150 ～0.200 cm3時(shí)開始治療。腫瘤體積計(jì)算公式:V =ab2π/6(a:腫瘤結(jié)節(jié)最大直徑;b:腫瘤結(jié)節(jié)最小直徑)。1.2.3 裸鼠人食管癌移植瘤的PDT 治療:將腫瘤體積達(dá)到規(guī)定大小的裸鼠隨機(jī)分為4 組，每組10 只。A組:荷瘤對(duì)照組(不注射HMME，不激光照射);B 組:單純HMME 組(按20 mg/kg 體質(zhì)量靜脈注射無血清DMEM 培養(yǎng)液配制的HMME 溶液，不進(jìn)行光照);C組:單純激光組(給予波長(zhǎng)630 nm 的激光輻照，能量密度為4 J/cm2，不注射HMME);D 組:HMME-PDT 治療組(按20 mg/kg 體質(zhì)量腹腔注射無血清DMEM 培養(yǎng)液配制的HMME 溶液，于暗室光敏化2 h 后給予波長(zhǎng)為630 nm 的激光輻照，能量密度為4 J/cm2。分別于各組處理后第1、3、7、14、21 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量每一個(gè)腫瘤大小，并重復(fù)測(cè)量3 次，按上述公式計(jì)算腫瘤體積算出平均腫瘤體積。

1.2.4 病理學(xué)檢查:上述各組荷瘤裸鼠治療后被處死，迅速取出瘤體并剖開經(jīng)10%甲醛液固定，制成石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用單因素方差分析和非參數(shù)的t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠人食管癌移植瘤的生長(zhǎng)情況 裸鼠接受ECA-109 人食管癌細(xì)胞種植后，于10 d 左右可形成種植瘤，直徑0.2 ～0.3 cm，可見背部局部隆起，呈不規(guī)則球形，約3 周時(shí)間瘤體直徑長(zhǎng)至0.6 ～0.8 cm，腫瘤體積0.150 ～0.200 cm3(見圖1)。

圖1 裸鼠人食管癌種植瘤的生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curve of human esophagus cancer xenografts in nude mice

2.2 裸鼠人胃癌移植瘤的PDT A、B、C 三組裸鼠的一般情況逐漸變差，后期因腫瘤體積增大而導(dǎo)致其行動(dòng)遲緩，D 組腫瘤體積增長(zhǎng)速度較其他三組明顯減緩。經(jīng)PDT 治療后腫瘤表面可見充血、發(fā)紅，而C 組出現(xiàn)暫時(shí)的皮膚輕度充血，A、B 組無明顯變化。

重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析顯示4 組間腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，A、B、C 三組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，D 組與A、B、C任一組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見表1)。D 組平均生存期達(dá)35 d，而A、B、C 三組平均生存時(shí)間只有24 d。

表1 四組裸鼠不同時(shí)間的平均腫瘤體積(±s)Tab 1 The mean tumor volumes of nude mice at different times in four groups (±s)

表1 四組裸鼠不同時(shí)間的平均腫瘤體積(±s)Tab 1 The mean tumor volumes of nude mice at different times in four groups (±s)

注:與D 組比較，* p ＜0.07。

A 組 10 0.189 ±0.006* 0.294 ±0.007* 0.414 ±0.011* 1.112 ±0.021* 1.615 ±0.036*B 組 10 0.185 ±0.012* 0.289 ±0.009* 0.406 ±0.008* 1.090 ±0.021* 1.602 ±0.028*C 組 10 0.183 ±0.008* 0.286 ±0.009* 0.408 ±0.006* 1.113 ±0.038* 1.616 ±0.036*D 組 10 0.182 ±0.011 0.186 ±0.007 0.220 ±0.008 0.34 8 ±0.003 0.522 ±0.024

2.3 病理學(xué)檢查 種植瘤組織切片HE 染色鏡檢:可見癌細(xì)胞形成癌巢，中央為環(huán)狀紅染的角化物，稱角化珠。細(xì)胞異型性明顯，多可見核分裂像。A、B、C 三組治療后腫瘤組織HE 染色鏡檢較治療前無明顯變化。D 組治療后腫瘤組織HE 染色鏡檢:腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞大片凝固性壞死，細(xì)胞明顯變性和細(xì)胞膜受損、破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，胞核固縮(見圖2)。

圖2 HMME-PDT 治療前后腫瘤組織病理圖片(HE 100 ×)A:治療前;B:治療后Fig 2 The pathology picture of tumor tissue before and after HMME-PDT treatment(HE 100 ×)A:before treatment;B:after treatment

3 討論

目前食管癌在我國(guó)的發(fā)病率居于世界前列，且90%為鱗狀細(xì)胞癌。多半患者確診時(shí)已是癌癥中期甚至晚期，手術(shù)切除及放、化療效果均不好，因此，迫切需要找出一種創(chuàng)傷小、副作用少的治療手段應(yīng)用于中晚期癌癥患者的姑息治療。PDT 是指光敏劑(Photosensi tizer)通過靜脈注射到患者體內(nèi)后，在一段時(shí)間內(nèi)光敏劑會(huì)被腫瘤組織特異性吸收并相對(duì)高濃度地聚集在其中，然后在避光的條件下，用一定波長(zhǎng)的激光照射腫瘤組織，在分子氧的參與下，在腫瘤組織內(nèi)引發(fā)一系列光化學(xué)反應(yīng)，生成具備細(xì)胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)一步對(duì)生物大分子(氨基酸、腺苷、脂肪酸等)產(chǎn)生氧化作用，殺死腫瘤細(xì)胞，并在很大程度上減少對(duì)正常細(xì)胞的傷害。

PDT 具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)直接下達(dá)病變組織部位，不會(huì)對(duì)周邊正常組織器官產(chǎn)生過多傷害;(2)可以利用內(nèi)鏡、超聲等方法將激光引入體腔，減少了因手術(shù)開體腔而造成的身體創(chuàng)傷;(3)光能利用率比較高，因此使用非常小的光功率便可以達(dá)到比較理想的效率;(4)輔助手術(shù)治療可以增加療效、降低復(fù)發(fā)率，從而提高患者的存活率。且大量實(shí)驗(yàn)證明HMME 可以高濃度地聚集在腫瘤組織表面，而周圍正常組織中一過性吸收或不吸收HMME，且正常組織中HMME 排泄較快，這樣既避免了放、化療給患者帶來的痛苦，又給腫瘤的治療提供了一種新途徑。

自從PDT 應(yīng)用于臨床以來，已被證實(shí)具有較好的臨床療效，由于其創(chuàng)傷小、副作用少，易于被患者接受，據(jù)研究［21-23］對(duì)于食管癌的一些癌前病變，PDT 的有效率可高達(dá)60%以上。至于HMME-PDT 對(duì)人食管癌細(xì)胞的具體殺傷機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)甚至國(guó)際尚缺乏有力的探究，僅有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)［24］在體外HMME-PDT 對(duì)人食管癌ECA-109 具有抑制及殺傷作用，而對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的作用效果尚缺乏研究。

本實(shí)驗(yàn)研究證明:HMME-PDT 可對(duì)人食管癌種植瘤產(chǎn)生一定的抑制作用，一方面體現(xiàn)在經(jīng)HMME-PDT治療后的腫瘤體積與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另一方面，這在組織病理學(xué)觀察中也得到了證實(shí)，PDT治療后腫瘤組織內(nèi)可見大量死亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞明顯變性和細(xì)胞膜受損、破裂;細(xì)胞內(nèi)容物外溢，胞核固縮，并可見到凋亡細(xì)胞，這在一定程度上說明了HMME-PDT 對(duì)人食管癌ECA-109 具有抑制及殺傷作用，可以為以后HMME-PDT 應(yīng)用于臨床治療食管癌提供一定的依據(jù)。

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