抗菌脂肽分離純化的研究

馮大興

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽(yáng) 110003）

抗菌脂肽分離純化的研究

馮大興

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽(yáng) 110003）

為分離、鑒定枯草芽孢桿菌S2株產(chǎn)生的抗菌脂肽類(lèi)化合物主要成分種類(lèi)和特性。本試驗(yàn)采用S2菌株的發(fā)酵液，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂XD吸附、洗脫，將產(chǎn)物與Surfactin（表面活性劑）標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行薄層色譜（TLC）分析，結(jié)果表明，S2菌株代謝產(chǎn)物主要為環(huán)狀脂肽類(lèi)化合物Surfactin。運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析技術(shù)對(duì)S2菌株產(chǎn)生的脂肽化合物Surfactin進(jìn)行了分離，對(duì)其在代謝產(chǎn)物中的含量及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并對(duì)其分子量進(jìn)行了推測(cè)，結(jié)果顯示,枯草芽孢桿菌S2菌株在發(fā)酵前期合成的抗菌脂肽類(lèi)化合物Surfactin（表面活性劑）含量達(dá)77.39%，分子量主要分布在1 036.693 3～994.644 9之間，通過(guò)研究進(jìn)一步確定了S2菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是Surfactin A、Surfactin B和Surfactin C的同系混合物。

枯草芽孢桿菌；抗菌脂肽；分離；分子量

細(xì)菌所產(chǎn)生的脂肽種類(lèi)繁多而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體現(xiàn)出各種生理特性[1]，即使是同一基本結(jié)構(gòu)的脂肽也同樣存在多種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，因?yàn)檫@些脂肽的結(jié)構(gòu)形態(tài)相似，性質(zhì)非常相近，因此，從細(xì)菌發(fā)酵液中分離純化取得單分子化合物是非常困難的。

本試驗(yàn)主要對(duì)提取所得抗菌脂肽進(jìn)行分離提純。利用大孔樹(shù)脂的吸附性，對(duì)抗菌脂肽粗提取物開(kāi)展吸附純化研究，確定純化流程，并為最終建立抗菌脂肽的規(guī)模生產(chǎn)工藝提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌S2。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（菌種培養(yǎng)用）、Landy培養(yǎng)基（發(fā)酵用）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 種子菌液培養(yǎng) 將保存的枯草芽孢桿菌S2菌株轉(zhuǎn)接至LB平板上，32℃培養(yǎng)20 h；用接種環(huán)取活化的單菌落，接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置32℃、180 r/min搖床培養(yǎng)20 h，4℃冰箱保存、備用。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 將枯草芽孢桿菌S2菌株接種到裝有50 mL Landy培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，接種量為5%，置32℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.3 抗菌脂肽粗提 取抑菌效果最佳菌株的最佳發(fā)酵階段的發(fā)酵液200 mL，10 000 r/min離心，棄去菌體，加入3%的大孔吸附樹(shù)脂XAD-16，室溫置于搖床震蕩，120 r/min，24 h。吸附后的樹(shù)脂用蒸餾水清洗至樹(shù)脂表面無(wú)抗菌脂肽發(fā)酵液殘留，然后置于200 mL具塞三角瓶中，加入60 mL無(wú)水乙醇，室溫下，置于搖床(120 r/min)振蕩洗脫24 h，然后減壓干燥，即為抗菌脂肽粗提物。

1.2.4 TLC（薄層色譜）抗菌脂肽[2]解析

1.2.4.1 解析TLC 層析支持物使用 Silica Gel GF254 20 cm×5 cm規(guī)格的硅膠板，用于層析的試劑配比為甲醇25（V）、三氯甲烷65（V）、水4（V）。第一步分別用少量的甲醇溶液溶解surfactin標(biāo)準(zhǔn)樣品和脂肽粗提物，然后制作若干塊硅膠板，在每塊板上同時(shí)點(diǎn)上樣品與標(biāo)品，進(jìn)行層析前要點(diǎn)樣，保存在層析試劑中，持續(xù)4 h，待完全揮發(fā)，一部分用0.4%的茚三酮染色、觀察，用密閉容器存放另一部分，這種容器應(yīng)耐高溫，容器內(nèi)放置盛有濃鹽酸的小杯，濃鹽酸大約2 mL，然后水解和冷卻原位酸，最后將鹽酸去除干凈，方法是將密閉容器放進(jìn)烘箱中，溫度控制在110℃，持續(xù)熏蒸，時(shí)間為3 h時(shí)，然后茚三酮染色，再一次放進(jìn)110℃烘箱內(nèi)熏蒸1 h后進(jìn)行觀察。

1.2.4.2 抗菌脂肽的收集 取同等條件下經(jīng)薄層層析后的分析板，在與其相對(duì)應(yīng)顯色部位刮取硅膠并將硅膠粉末收集，用甲醇進(jìn)行浸泡洗脫、濃縮后，即為抗菌脂肽純品，供HPLC和LC-MS分析。

1.2.5 HPLC分離純化抗菌脂肽

1.2.5.1 色譜條件 RP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μL，pH1-14）。

流動(dòng)相：A：水（含0.1%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)）；B：乙腈（Acetonitrile，ACN）；0～50 min，

A：40%～95%，B：60%～5%

流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.5.2 樣品處理 上述脂肽粗提物，用流動(dòng)相溶解。

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)品 脂肽類(lèi)物質(zhì)surfactin，用流動(dòng)相溶解。

首先把標(biāo)品surfactin進(jìn)行HPLC層析，待完成后，將色譜柱平衡結(jié)束，再加上樣品進(jìn)行等梯度洗脫，將脂肽化合物樣品進(jìn)行分離，重復(fù)3次收集洗脫液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的出峰時(shí)間，初步判斷脂肽類(lèi)型。

1.2.6 LC-MS（液質(zhì)聯(lián)用）分析脂肽

1.2.6.1 HPLC（高效液相色譜）分析抗菌脂肽 ①色譜條件： RP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm，PH1-14）。②流動(dòng)相：A：水（含0.1%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid， TFA)）；B：乙腈（Acetonitrile，ACN）。③流速：1 mL/min，梯度洗脫條件如下圖。④檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

表1 梯度洗脫條件Table1 Gradient elution condition

將脂肽粗提物采用進(jìn)行HPLC（DI0NEX U3000）分離純化，surfactin標(biāo)準(zhǔn)樣品也在相同條件下進(jìn)行層析。

1.2.6.2 MS（質(zhì)譜）分析脂肽 采用Agilent 6540 Q-T0F LC/MS液質(zhì)聯(lián)用分析。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

將HPLC收集的1～9個(gè)峰直接用200 μL的進(jìn)樣針進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣。采用ESI-MS測(cè)定脂肽類(lèi)化合物相對(duì)分子質(zhì)量，然后對(duì)一級(jí)質(zhì)譜的主要離子峰實(shí)施ESI-MS分析。

2 結(jié)果與分析

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)Table2 Mass spectrometry parameters

2.1 S2菌株抗菌物質(zhì)TTLLCC層析結(jié)果通過(guò)對(duì)S2菌株產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物與標(biāo)品Surfactin進(jìn)行TLC分析、觀察（圖1），結(jié)果顯示，硅膠板經(jīng)過(guò)層析后，直接噴灑茚三酮染色劑后加熱，樣品不顯色，如圖1（A板）所示，薄層硅膠板A中樣品1、樣品2以及標(biāo)品surfactin在相應(yīng)部位均沒(méi)有顯示，說(shuō)明標(biāo)品和樣品中它們的分子結(jié)構(gòu)均呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有游離氨基酸存在；采用濃HCl進(jìn)行原位水解后，冷卻、吹凈鹽酸后發(fā)現(xiàn)，在相應(yīng)部位能見(jiàn)到標(biāo)品及樣品的痕跡，見(jiàn)圖1（B-1板）；再用茚三酮染色，再一次放進(jìn)110℃烘箱內(nèi)熏蒸1 h后，在對(duì)應(yīng)位置處樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均能顯色，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)均已經(jīng)打開(kāi)，有游離氨基酸存在，如圖1（B-2板）。根據(jù)圖1顯示，薄層板上樣品與標(biāo)品兩個(gè)顯色斑點(diǎn)所處的位置進(jìn)行比較，表明它們遷移的速度一致，即兩者所帶的電荷相似。初步判斷該樣品與標(biāo)品屬于同一類(lèi)脂肽化合物，即surfactin或surfactin同系物。

圖1 GD菌株脂肽粗提物TLC層析結(jié)果Fig.1 The TLC chromatography results of GD strains lipopeptide crude extracts

2.2 S2菌株脂肽HHPPLLCC分離純化結(jié)果通過(guò)對(duì)S2菌株脂肽化合物粗提物與標(biāo)準(zhǔn)品surfactin分別經(jīng)HPLC分離及比較后觀察，見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)樣品粗提物所形成的色譜峰都能與標(biāo)品surfactin產(chǎn)生的7個(gè)色譜峰保留時(shí)間重疊合，表示它們的分子量大小基本一致，且下標(biāo)紅色圓圈處色譜峰得到較好的分離。說(shuō)明菌株S2產(chǎn)生的脂肽屬于surfactin類(lèi)即是surfactin同系物。

2.3 菌株 S2脂肽粗提物幾個(gè)主峰的含量比較根據(jù)從S2菌株粗提物樣品在HPLC上的出峰保留時(shí)間來(lái)看（表1和圖3），S2菌株粗提物主要幾個(gè)色譜峰在柱上保留時(shí)間在12～19 min之間。由此可見(jiàn)，S2脂肽粗提物是由surfactin同系物中多個(gè)組分構(gòu)成。

圖2 菌株GD脂肽粗提物與標(biāo)品HPLC保留時(shí)間對(duì)比Fig.2 The comparison of retention time between GD strains lipopeptide crude extracts and HPLC standard product

圖3 GD粗提物樣品HPLC出峰保留時(shí)間Fig.3 The HPLC peak retention time of GD strains lipopeptide crude extracts

表3 S2粗提物樣品HPLC出峰保留時(shí)間及面積Table3 The HPLC peak retention time and area of crude extracts

根據(jù)圖3、表3中峰面積統(tǒng)計(jì)顯示，S2脂肽粗提物在12.393～19.011 min保留時(shí)間內(nèi)出峰面積占整個(gè)出峰面積的77.39%。

2.4 菌株 S2脂肽類(lèi)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量分析通過(guò)采用Agilent 6540 Q-T0F LC-MS液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)菌株S2脂肽粗提物在HPLC柱上洗脫中出現(xiàn)的峰（圖4-0），按照時(shí)間先后順序?qū)⒊霈F(xiàn)的9個(gè)洗脫峰分別做質(zhì)譜分析（圖4-1～4-9和表2），結(jié)果表明，菌株S2發(fā)酵30 h時(shí)產(chǎn)生的脂肽化合物主要是由surfactin同系物組成，其分子量(m/z)分布在994.644 9、1 008.660 5、1 022.677 3和1 036.693 3附近。說(shuō)明S2菌株產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物主要包括surfactinA、B和C，同時(shí)還含有少量其他類(lèi)型的脂肽化合物。

圖4-0

圖4-1

圖4-2

圖4-3

圖4-4

圖4-5

圖4-6

圖4-7

圖4-8

圖4 菌株GD脂肽化合物的LC-MS質(zhì)譜圖Fig.4 The LC-MS mass spectrogram of GD strains lipopeptide

通過(guò)進(jìn)一步比較、分析，4號(hào)、5號(hào)峰及7號(hào)、6號(hào)分子量分別是1 008.660 5、1 008.660 6與1 022.677 3、1 022.677 4，它們相差14.006 8，表明它們之間相差1個(gè)碳?xì)錃埢?CH2-）；4號(hào)和7號(hào)峰的分子量分別為1 008.660 5和1 008.660 6，5號(hào)峰與6號(hào)峰的分子量分別為1 022.677 3與1 022.677 4，雖然它們分子量一樣，但它們的出峰時(shí)間有先后之分，不屬于真正意義上的同一種化合物。說(shuō)明4號(hào)、5號(hào)峰及7號(hào)、6號(hào)是同系物；4號(hào)和7號(hào)峰以及5號(hào)峰和6號(hào)峰它們分別屬于各自的同分異構(gòu)體或構(gòu)象異構(gòu)體。

3 討論

抗菌脂肽分子是由親水性肽鏈（7至10個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈）和親油性脂肪酸鏈（β-羥基脂肪酸鏈或則β-胺基脂肪酸鏈）兩部分組成的，其中脂肪酸鏈上-0H或-NH2與肽鏈上氨基酸-C00H結(jié)合構(gòu)成內(nèi)酯鍵或酰胺鍵，導(dǎo)致肽鏈閉合形成而環(huán)狀脂肽[3]。通過(guò)對(duì)S2菌株產(chǎn)生出的抗菌脂肽化合物和標(biāo)品Surfactin進(jìn)行TLC分析、觀察，以及通過(guò)對(duì)S2菌株脂肽化合物粗提物和標(biāo)準(zhǔn)品surfactin分別經(jīng)過(guò)HPLC分離及比較等試驗(yàn)，初步判斷菌株S2產(chǎn)生的脂肽屬于surfactin類(lèi)，也就是surfactin同系物。由于不存在暴露或游離的氨基，屬環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與國(guó)內(nèi)外諸多報(bào)道一致[4]。

S2脂肽粗提物是由surfactin同系物中的多個(gè)組分組成。運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析的技術(shù)對(duì)S2菌株產(chǎn)生出的脂肽化合物surfactin進(jìn)行了分離，并對(duì)其在代謝產(chǎn)物中的含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，對(duì)其分子量進(jìn)行推測(cè)，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌S2菌株在其發(fā)酵前期合成的抗菌脂肽類(lèi)化合物surfactin（表面活性劑）的含量達(dá)77.39%，分子量主要分布于1 036.693 3～994.644 9之間。

微生物產(chǎn)生的抗菌脂肽種類(lèi)較多，結(jié)構(gòu)比較特殊、復(fù)雜，體現(xiàn)出各種生理特性[5]。通過(guò)菌株S2脂肽類(lèi)化合物相對(duì)分子質(zhì)量的分析，采用了Agilent 6540 Q-T0F LC-MS液質(zhì)聯(lián)用分析的技術(shù)，對(duì)菌株S2脂肽的粗提物在HPLC柱上洗脫中出現(xiàn)的峰值，按照時(shí)間的先后順序?qū)⒊霈F(xiàn)的9個(gè)洗脫峰值分別做質(zhì)譜分析，進(jìn)一步確定出S2菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物就是surfactin A和surfactin B、surfactin C的同系混合物。

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[2]PeypouxF.,BonmatinJ.,WallachJ.Recent trends in the biochemistry of surfactin[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51(5):553-563.

[3]呂應(yīng)年，楊世忠，牟伯中.脂肽類(lèi)生物表面活性劑的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2004（6）：11-16.

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2015年《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》雜志征訂啟事

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Research on isolation and purification of antimicrobial peptides

Feng Daxing
（Animal product safety monitoring Institute of Liaoning Province，Liaoning Shenyang 110003）

For isolation and identification of S2 strains of bacillus subtilis producing fat antibacterial peptide compound main component types and features.Test using S2 strains fermented liquid,by macroporous adsorption resin adsorption and elution,XD product with Surfactin(surfactant)standard and thin layer chromatography(TLC)analysis.The results show that the S2 main strainmetabolitesincircularSurfactinfatpeptidecompounds;Usingliquidmasscombination (LC-MS)analysis technology of S2 strains produce fat Surfactin peptide compounds of separation and its metabolites in the content and structure are analyzed,and its molecular weight is speculated that,according to the results of S2 strains of bacillus subtilis in the early stage of the fermentationSurfactinsyntheticfatantibacterialpeptidecompounds(surfactant)contentwas 77.39%,and the main distribution of molecular weight between 1 036.693 3 994.644 9,through further research to determine the metabolites produced by the strain S2 is Surfactin,Surfactin B and Surfactin C homologous mixture.

Bacillus subtilis;Antimicrobial peptides;Separation;Molecular weight

S859.79

1672-9692(2015)11-0009-08

2015-10-10

馮大興（1985-），男，碩士，畜牧師，研究方向?yàn)楂F藥、飼料、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。