雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離及其鑒定的研究

楊淑華，于立輝，張 燚，龍 淼，李 林，高 鋒，姜麗瑩，韓 陽，王 雪，何劍斌

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離及其鑒定的研究

楊淑華，于立輝，張 燚，龍 淼，李 林，高 鋒，姜麗瑩，韓 陽，王 雪，何劍斌★

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

為了尋找一種快速、高效的體外分離、純化雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，本試驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶消化以及PercoII分離液梯度離心，建立雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離、純化方法。結(jié)果表明，PercoII分離液梯度離心后，純化的間質(zhì)細(xì)胞3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）染色陽性率可達(dá)92.5%±1.7%，且在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)的細(xì)胞生長良好。該提取方法效果良好，可作為研究禽類生殖調(diào)控的細(xì)胞模型。

雞；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；3β-HSD染色；梯度離心法

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cell）又稱Leydig cell，1850年由Leydig首先發(fā)現(xiàn)并加以描述，20世紀(jì)60年代確定它是合成分泌雄激素的內(nèi)分泌細(xì)胞，分布在睪丸生精小管間的疏松結(jié)締組織內(nèi)，其含量占睪丸細(xì)胞數(shù)量的2%～4%[1]。其主要功能是分泌睪酮，分泌活動(dòng)受丘腦下部、垂體及自身的調(diào)節(jié)，動(dòng)物體內(nèi)約95%的睪酮由間質(zhì)細(xì)胞分泌[2]，睪酮被運(yùn)輸?shù)缴眢w各處的靶器官，通過與受體結(jié)合發(fā)揮重要的生理功能[3-4]。目前，國內(nèi)外對(duì)大鼠、小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究較多[5-8]，其他哺乳動(dòng)物間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究也有報(bào)道[9-10]，但禽類睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離及鑒定培養(yǎng)尚無研究。本試驗(yàn)在參閱相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，以Ⅱ型膠原酶消化睪丸組織，利用3β-HSD染色法對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用PercoII密度梯度離心法純化分離的雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞，獲得高純度的雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞，為完善禽類睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑去氫表雄酮（DHEA）、吖啶橙、0.25%Trypsin-EDTA、二甲基亞砜（DMS0）、MTT、DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液、Percoll細(xì)胞分離液，膠原酶Ⅱ型系購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無支原體胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；慶大霉素購于哈藥集團(tuán)制藥總廠；異丙醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；臺(tái)盼蘭購于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物2.5月齡的雄性海蘭雞，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)場提供。

1.3主要試劑的配制 3β-HSD染液的配制：稱取DHEA 0.0072 g，NAD0.159，NBT0.059，尼克酰胺0.08 g；DHEA溶于2.5 mL丙酮中，可加熱助溶；然后將所有物質(zhì)溶于40 mL的D-Hank’s液中，攪拌使其允分溶解，用0.22 μm的微孔過濾器過濾除菌，分裝后4℃保存?zhèn)溆?，長期保存在-20℃。

1.4 Leeyyddiigg細(xì)胞的分離與純化①取2月齡左右雄性雞，頸椎脫臼法處死，浸入75%乙醇中5 min，放入無菌的托盤，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)內(nèi)，雙側(cè)腹股溝管內(nèi)側(cè)斜切U型切口，用眼科剪和鑷子小心提起睪丸，去除其周圍的脂肪組織，從附睪尾部剪斷精索，獲取完整的睪丸。②將睪丸浸入有少量冰冷的D-Hank’s緩沖液的培養(yǎng)皿中，沖洗3遍。置于另一無菌培養(yǎng)皿中，小心地剝?nèi)ゲG丸被膜，并盡量剔去睪丸組織內(nèi)的細(xì)小血管，保持睪丸形態(tài)的完整和曲細(xì)精管的連續(xù)性，用D-Hank’s液沖洗睪丸實(shí)質(zhì)1遍。③將分離干凈的睪丸實(shí)質(zhì)放入無菌的小青瓶內(nèi)，按體積比1:5的比例加入膠原酶Ⅱ（1 mg/mL），密封瓶口。37℃，振蕩消化約l0 min，至睪丸組織形狀剛好消失，曲細(xì)精管間組織松散但連續(xù)而無明顯斷裂時(shí)，加入適量無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。④消化液經(jīng)200目不銹鋼篩過濾，濾液于4℃，1 000 r/min離心8 min，去上清。細(xì)胞沉淀用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋，將細(xì)胞懸液加于Percoll梯度液上（由下到上依次為70%、60%、30% Percoll各3 mL），低溫離心30 mi（n4℃，3 000 r/min）。離心后，在管內(nèi)可看到1條明顯的目的細(xì)胞帶，取出后，加入適量無血清DMEM/F12培養(yǎng)基充分混勻細(xì)胞，4℃，1 000 r/min離心8 min，去上清，反復(fù)操作一次以盡可能洗去殘存的Percoll分離液。獲得較純化的間質(zhì)細(xì)胞，加入適量含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。

1.5 Leeyyddiigg細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞濃度調(diào)至5.0×105個(gè)/mL，接種后在37℃、5%C02、95%02和飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.6 Leeyyddiigg細(xì)胞活力的鑒定取上述分離純化的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105個(gè)/mL，吸取10滴Leydig細(xì)胞懸液和l滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，靜置3 min。健康細(xì)胞排斥臺(tái)盼藍(lán)而不被染色，喪失細(xì)胞膜完整性的死細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，計(jì)算細(xì)胞活率。計(jì)算公式如下：

1.7 33β--HHSSDD染色鑒定Leeyyddiigg細(xì)胞由于睪丸組織內(nèi)僅睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD），故睪丸間質(zhì)細(xì)胞可被特異性的染成藍(lán)色。取要鑒定的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0× 105個(gè)/mL，按2:1比例加入已配制的3β-HSD染液，放入C02培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育5 h，在顯微鏡下選取多個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)所有細(xì)胞及染成藍(lán)色的細(xì)胞，計(jì)算Leydig細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Leeyyddiigg細(xì)胞存活率的測定結(jié)果純化、分離后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液染色后在光鏡下觀察，共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，其中死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染，重復(fù)記錄4次，計(jì)算結(jié)果顯示，間質(zhì)細(xì)胞存活率為95.0%±1.3%。

2.2 33β--HHSSDD染色結(jié)果采用Percoll分離液梯度離心法分離、純化雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)3β-HSD染色鑒定睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈藍(lán)色，純化前睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度為46.6%±2.3%（n=5），純化后睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度為92.5%±1.7%（n=5）。睪丸細(xì)胞經(jīng)Percoll分離液純化前后3β-HSD染色結(jié)果見圖1和圖2。

3 討論

3.1 雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離與純化睪丸既是產(chǎn)生精子的器官，又是分泌雄性激素的內(nèi)分泌器官。目前，對(duì)睪丸生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)以組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶消化法為主?？棄K培養(yǎng)法操作簡便，但對(duì)雜細(xì)胞的污染不容易控制；胰蛋白酶消化法利用酶對(duì)組織間質(zhì)的作用使細(xì)胞團(tuán)分散成單個(gè)細(xì)胞，使用此法能獲得大量的活細(xì)胞，較快地建立細(xì)胞系，但胰酶會(huì)作用于細(xì)胞膜，長時(shí)間的胰酶環(huán)境會(huì)使細(xì)胞受到損傷。Ⅱ型膠原酶能滲透到睪丸組織內(nèi)部，使膠原酶充分消化間質(zhì)，本試驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶消化效果較好。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒，無毒、惰性，且與生物膜不發(fā)生黏附，利用它分離的細(xì)胞能保持完整的生物學(xué)活性。以往研究表明，利用Percoll梯度離心法分離大鼠、小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞可獲得較高的純度[1,12-13]。本試驗(yàn)采用30%、60%及70%的Percoll梯度分離液分離睪丸間質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)離心后，純化的睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要集中在30%與60%Percoll濃度之間，此濃度范圍內(nèi)獲得的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的純度較高，形態(tài)典型，且體外細(xì)胞的特征與前人報(bào)道的一致[5]。本試驗(yàn)分離純化的睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率為95.0%±1.3%，說明分離、純化操作過程規(guī)范，對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷較小。

圖1 純化前間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD染色（200×）Fig.1 Before purification of interstitial cells stained with 3β-HSD(200 x)

圖2 純化后間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD染色（200×）Fig.2 Purified Leydig cells stained with 3β-HSD(200 x)

3.2 雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的 33β--HHSSDD染色鑒定3β-HSD是甾體類激素合成的關(guān)鍵酶之一，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，僅見于睪丸間質(zhì)細(xì)胞光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，是公認(rèn)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的鑒定指標(biāo)，是睪丸間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志酶[5-7]。在3β-HSD染色液的作用下，細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色的即為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。本試驗(yàn)基于這一特征對(duì)分離、純化的雞睪丸細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定，結(jié)果表明，所分離純化的細(xì)胞92.5%±1.7%是睪丸間質(zhì)細(xì)胞。本試驗(yàn)成功建立了雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離、純化方法，為研究禽類的生殖試驗(yàn)提供體外細(xì)胞模型。

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The Isolation and Examination of Rooster Testis Leydig Cell

Yang Shuhua,Yu Lihui,Zhang Yi,Long Miao,Li Lin,Gao Feng, Jiang Liying,Han Yang,Wang Xue,He Jianbin*
(Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866)

To find a high-efficient way to digest and purify rooster leydig cells.Methods:A multistep procedure including vascuIar perfusion,dissociation of type II collagenase and PercoII gradient centrifugation was employed.ResuIts:The purfied Leydig cell fraction after PercoII density-gradient centrifugation contained 92.5%±1.7%well-preserved 3β-hydroxysteroid dehydrogenase（3β-HSD）,The better cultural condition was 37℃,5%C02.ConcIusion:It suggests that the method is reIiabIe and has somewhat applicant prospect.

Cock;Leydig cell;3β-HSD;Gradient centrifugation

Q813

1672-9692(2015)11-0006-03

2015-09-29

楊淑華(1973-)，女，講師，博士，從事畜禽營養(yǎng)代謝病與中毒病研究。

何劍斌(1969-)，男，教授，博士，從事動(dòng)物產(chǎn)科疾病的診斷與治療。

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年基金(20121007)