莊河大骨雞抗粘液病毒基因和溶菌酶基因多態(tài)性的研究

張雪瑩，任慧慧，田玉民，朱弘焱，蘇玉虹

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

莊河大骨雞抗粘液病毒基因和溶菌酶基因多態(tài)性的研究

張雪瑩，任慧慧，田玉民，朱弘焱★，蘇玉虹★

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

為研究莊河大骨雞抗粘液病毒基因（myxovirus resistant，Mx）和溶菌酶基因（lysozyme，LYZ）的多態(tài)性，本試驗從大骨雞血液中提取DNA，PCR擴(kuò)增Mx和LYZ基因后分別進(jìn)行RsaI和Hind III酶切及瓊脂糖凝膠電泳。研究結(jié)果表明，所選取的262只莊河大骨雞Mx基因片段均能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為101 bp，經(jīng)酶切后獲得GG、GA和AA 3種基因型，基因型頻率分別為0.744、0.229、0.027，因此大骨雞Mx基因具有多態(tài)性；所選取的120只大骨雞LYZ基因片段也均能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為590 bp，經(jīng)酶切后僅獲得一種基因型GG型，因此該基因此酶切位點上無多態(tài)性。本研究為莊河大骨雞資源保存、品種選育和開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

莊河大骨雞；抗粘液病毒基因；溶菌酶基因；內(nèi)切酶RsaⅠ；內(nèi)切酶HindⅢ

“莊河大骨雞”又名“莊河雞”，是我國著名的肉蛋兼用型地方良種，主產(chǎn)于大連莊河市境內(nèi)，具有耐粗飼、體大、蛋大、毛色艷麗、肉味鮮美、營養(yǎng)價值高的特點，是遼寧省畜牧業(yè)“四大名旦”之一[1-3]。與引進(jìn)肉食雞和蛋雞相比，莊河大骨雞整體抗病力強(qiáng)，因此對大骨雞抗病相關(guān)遺傳特點的研究及開發(fā)利用具有重要的意義。

抗粘液病毒基因（myxovirus resistant，Mx）是家禽抗病力的重要候選基因之一，其蛋白是抗病毒蛋白的一種，由I型干擾素誘導(dǎo)后，在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，含有GTP酶活性[4]；抗病毒譜較廣，可以抑制多種負(fù)鏈RNA病毒，還能抵抗某些DNA病毒。現(xiàn)有研究證明[4]，禽Mx蛋白具有抗A型流感病毒、水泡性口膜炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）等病毒的生物活性。Mx基因的存在方式是顯性等位基因，研究發(fā)現(xiàn)[5]，通過克隆多個品系的雞Mx基因并將序列比對，發(fā)現(xiàn)有25個核苷酸突變，其中15個導(dǎo)致了氨基酸的改變，預(yù)示雞的Mx基因具有多態(tài)性。另有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，在眾多氨基酸改變中，當(dāng)cDNA的2032位點為A，即雞Mx蛋白的第631位氨基酸為天冬酰胺（Asn）時，該蛋白對流感病毒和VSV有抗性，而當(dāng)此位點為G，即Mx蛋白的第631位氨基酸為絲氨酸（Ser）時則無抗性。

1,4-0-溶菌酶（lysozyme，LYZ）又稱N-乙?；谒崴饷?，最早由Baldacci等[8]于1979年從雞的兩個基因庫中用分子克隆的方法純化獲得，全長約3.9 kb。其屬于堿性水解酶，是體內(nèi)重要的非特異性體液免疫因子，在內(nèi)部滲透壓的作用下引起細(xì)菌裂解[9-10]，有些溶菌酶還可發(fā)揮消化酶的作用，對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性菌和真菌具有直接或間接的溶解作用，能夠起到殺菌、抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞等多種作用，在免疫系統(tǒng)中起著重要作用。

本研究旨在通過對莊河大骨雞Mx和LYZ基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，篩選出對兩基因抗性的個體，為大骨雞候選基因標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)，同時為大骨雞抗病優(yōu)良品種選育提供分子遺傳學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選用遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院科研團(tuán)隊養(yǎng)殖的莊河大骨雞，隨機(jī)挑選262只健康雌雞單籠飼養(yǎng)于同一雞舍，管理條件完全相同，日糧參照美國NRC營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試驗儀器與試劑蛋白酶K、瓊脂糖、DL2000 Marker、DL1000 Marker、DL5000 Marker、20 bp DNA Ladder、限制性內(nèi)切酶RsaI、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均購自大連寶生物工程有限公司；其他均為分析純試劑。試驗儀器均為國產(chǎn)或進(jìn)口設(shè)備，如超凈工作臺、高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴箱、PCR擴(kuò)增儀、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、超純水系統(tǒng)、-70℃超低溫冰箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 大骨雞血液基因組DNA提取及質(zhì)量檢測 取大骨雞靜脈血2 mL，用裂解液、蛋白酶K和SDS進(jìn)行細(xì)胞裂解，用酚、氯仿和異戊醇提取基因組DNA。將提取的大骨雞基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測DNA質(zhì)量。

1.3.2 Mx、LYZ PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上基因序列號（LYZ基因：NC_006127.3；Mx基因：AF289468.1），使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計引物。Mx基因引物序列，F(xiàn)：CCTTCAGCCTGTTTTTTCTTCTTTTAGG，R：CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA，產(chǎn)物大小為101 bp，LYZ基因引物序列，F(xiàn)： GCCACATAAAGTTTGAGC， R：GTACTCCCATCGGTGTTA，產(chǎn)物大小為590 bp。

1.3.3 大骨雞Mx、LYZ基因片段PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)組分如下：模板DNA 1 μL，引物（20 pmol/μL）各1 μL，mix混合液7.5 μL，加超純水至15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，Mx基因55℃退火45 s、LYZ基因49.3℃退火45 s，72℃延伸45 s；30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳，紫外燈下觀察并照相。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切及電泳檢測 根據(jù)Mx、LYZ基因序列，利用Primer 5.0分析可知上述擴(kuò)增片段內(nèi)含有內(nèi)切酶RsaI和內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點。限制性內(nèi)切酶RsaI和HindⅢ的酶切反應(yīng)體系按內(nèi)切酶說明書要求，PCR產(chǎn)物10 μL，內(nèi)切酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 2 μL，加超純水至20 μL，37℃恒溫3～4 h，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大骨雞血液基因組DDNNAA質(zhì)量檢測大骨雞血液DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。圖1可見大分子量的DNA條帶，為基因組DNA。

2.2 大骨雞MMxx、LLYYZZ基因 PPCCRR擴(kuò)增結(jié)果采用所設(shè)計的引物，PCR擴(kuò)增大骨雞Mx、LYZ基因的部分片段，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2和圖3。由圖2可見，Mx基因PCR產(chǎn)物大小約為101 bp，由圖3可見，LYZ基因PCR產(chǎn)物大小約590 bp，均符合預(yù)期的擴(kuò)增長度，可以用來進(jìn)行RFLP分析。

圖1 大骨雞血液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA for blood samples of Zhuanghe Dagu chicken

圖2 大骨雞Mx基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR ofMxin Zhuanghe Dagu chicken

圖3 大骨雞LYZ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR ofLYZin Dagu chicken

2.3 PPCCRR產(chǎn)物酶切結(jié)果試驗所設(shè)計的Mx基因PCR上下游引物間的具有一個RsaI酶切位點，大骨雞Mx基因PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果見圖4，條帶大小為101、74和27 bp，酶切后出現(xiàn)了3種帶型，說明本試驗檢測的262只大骨雞Mx基因具有多態(tài)性；試驗所設(shè)計的LYZ基因PCR上下游引物間的具有一個HindⅢ酶切位點，大骨雞LYZ基因PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果見圖5，條帶大小為414 bp和176 bp，酶切后僅出現(xiàn)一種帶型，說明試驗檢測的120只大骨雞LYZ基因不具有多態(tài)性。

圖4 大骨雞Mx基因PCR產(chǎn)物酶切后凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for PCR products ofMxin Dagu chicken

圖5 大骨雞LYZ基因PCR產(chǎn)物酶切后凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for PCR products ofLYZin Dagu chicken

3 討論

本試驗用PCR-RFLP法擴(kuò)增大骨雞的Mx、LYZ基因，Mx基因片段長為101 bp，經(jīng)RsaI酶切后電泳，檢測到該位點有兩種等位基因A、G，三種基因型GG、GA和AA，基因型頻率分別為0.744、0.259、0.027。結(jié)果顯示，大骨雞Mx基因具有多態(tài)性，并且抗性等位基因A的頻率為0.141。據(jù)文獻(xiàn)報道，吳曉偉等[11]檢測的中國地方雞種中的肉蛋兼用型的Mx基因抗性等位基因A的頻率為0.297，其檢測的莊河大骨雞的抗性等位基因A的頻率為0.100，檢測的紅色原雞的抗性等位基因A的頻率為0.984；李慧芳等[12]檢測的在12個中國地方雞種中Mx基因抗性等位基因A的頻率的平均值為0.304；欒德琴等[13]檢測的Mx基因在11個不同雞種中抗性等位基因A的頻率的平均值為0.502，這與本試驗結(jié)果存在一定差異，但本試驗中大骨雞該抗性等位基因的頻率高于吳曉偉等[11]的檢測結(jié)果。

LYZ基因片段長為590 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ對擴(kuò)增片段進(jìn)行完全酶切后僅產(chǎn)生GG基因型（176 bp和414 bp），LYZ基因不具有多態(tài)性。據(jù)文獻(xiàn)報道，侯啟瑞等[10，14]發(fā)現(xiàn)LYZ基因有4處突變位點，第111、1 411、1 426和1 492位點（其中111位點位于第一外顯子，1411位點位于第1內(nèi)含子，1 426位點和1 492位點位于第2外顯子）。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)第1 411位點，等位基因G和A的頻率分別為0.561和0.439，該位點對京海黃雞不同周齡體重有顯著影響，AA、GA基因型個體4周齡體重顯著高于GG基因型個體4周齡體重，暗示在選種、育種過程中亦可將雞LYZ基因作為京海黃雞體重和開產(chǎn)日齡候選基因應(yīng)用于遺傳標(biāo)記輔助選擇。因此本試驗選取該位點檢測，但未檢出多態(tài)性與文獻(xiàn)報道存在一定差異，可能與品種以及不同品種之間的各自生存環(huán)境有關(guān)，也可能是多態(tài)性基因型頻率低，受檢樣本量不足以檢測出多態(tài)性。為更加確切地探明該基因在大骨雞上是否存在多態(tài)性位點，需進(jìn)一步通過測序鑒定。

本研究利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)篩選出與大骨雞抗病性能相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記-Mx和LYZ基因，對其遺傳特點進(jìn)行了研究，填補(bǔ)了莊河大骨雞Mx和LYZ基因多態(tài)性的研究空白，后續(xù)將通過試驗研究來進(jìn)一步揭示大骨雞抗病性基因的多態(tài)性與相關(guān)性狀間的關(guān)系，來豐富家禽分子育種理論，加快育種步伐，為大骨雞良種選育提供理論依據(jù)。

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Study on polymorphism of myxovirus resistant gene and lysozyme gene in Zhuanghe Dagu Chicken

Zhang Xueying,Ren Huihui,Tian Yumin,Zhu Hongyan*,Su Yuhong*
(College of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001)

To analyze the polymorphism of myxovirus resistant(Mx)and lysozyme(LYZ)gene for Zhuanghe Dagu chicken,The technology of PCR-RFLP was used.The PCR products were digested with enzyme RsaI and HindⅢ.HindⅢ locus polymorphism of LYZ in Zhuanghe Dagu chicken was not detected,RsaI locus polymorphism of Mx was divided into three kinds of genotypes of GG,GA and AA, and the frequencies of genotypes were 0.744、0.229 and 0.027.The research provided the scientific basis for the resource preservation,variety breeding and the development and utilization of Zhuanghe Dagu chicken.

Zhuanghe Dagu chicken;Myxovirus resistant gene;Lysozyme gene;Enzyme RsaⅠ;Enzyme HindⅢ

S831

1672-9692(2015)11-0001-05

2015-09-11

張雪瑩（1993-），女，本科。

朱弘焱（1984-），女，碩士，講師，研究方向為動物分子遺傳育種。

蘇玉虹（1965-），女，博士，教授，研究方向為畜禽的遺傳和育種。

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新課題（201410160010）、遼寧省科技廳計劃項目（2014209006）、遼寧省自然科學(xué)基金項目（2015020765）及遼寧醫(yī)學(xué)院領(lǐng)軍人物資助項目