人參莖葉總皂苷對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的影響

人參莖葉總皂苷對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的影響

劉佳張敬敬李明陽石高星曾志能魏珊珊

(長沙醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，湖南長沙410219)

摘要〔〕目的探討人參莖葉總皂苷(GSLS)對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的影響。方法GSLS以低、中、高劑量5、20、80 mg·kg-1·d-1給小鼠灌胃，模型組和空白組以生理鹽水灌胃；同時，除空白組外，其他組每天頸背部皮下注射D-半乳糖制備亞急性衰老模型；連續(xù)灌胃和注射42 d。計算小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗衡量淋巴細胞增殖能力，測定巨噬細胞吞噬能力。結(jié)果模型組與空白組比較，巨噬細胞吞噬率下降(P<0.01)，其他各項免疫力檢測值差異不顯著；與模型組比較，GSLS灌胃中、低劑量組胸腺指數(shù)上升(P<0.05)，中劑量組的巨噬細胞吞噬率明顯增大(P<0.01)，中、低劑量組巨噬細胞吞噬指數(shù)顯著上升(P<0.01)，其他免疫指標變化不顯著。結(jié)論GSLS可通過增加胸腺比重、強化巨噬細胞功能從而改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的免疫力。

關鍵詞〔〕人參莖葉總皂苷；免疫力；衰老；D-半乳糖

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：湖南省教育廳科學研究項目(13C1131)

通訊作者：張敬敬(1977-)，女，碩士，講師，主要從事衰老的細胞生物特性研究。

第一作者：劉佳(1979-)，女，碩士，講師，主要從事抗衰老的生物機制研究。

近年來，國內(nèi)學者對人參有效成分進行了科學研究，確認了人參具有抗腫瘤、抗輻射、抑制中樞疲勞、改善微循環(huán)等作用〔1〕。前期實驗證實人參莖葉總皂苷(GSLS)在一定程度上具有抗衰老作用。免疫功能減退導致機體老化是衰老的重要學說，即高等動物隨著增齡，免疫器官功能會逐漸下降，細胞功能失調(diào)、抵抗力降低因而容易受到不利因素侵擾，趨向于老化和衰弱〔2〕。本課題探討GSLS對衰老小鼠的免疫力的影響。

1材料與方法

1.1動物、試劑及儀器SPF級昆明小鼠，雄性，體重(22±2)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，批號43004700000890，長沙醫(yī)學院湖南省重點建設學科標準動物室飼養(yǎng)。GSLS，含量≥80%UV，購自吉林省宏久生物科技公司。D-半乳糖購自Genview公司。植物血凝素(PHA)購自上海伊華醫(yī)學科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。20%雞紅細胞懸液，自備。生物顯微鏡及數(shù)碼成像設備(德國Motic公司)。

1.2方法40只小鼠適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為五組：空白組，模型組，GSLS低、中、高劑量組(5、20、80 mg·kg-1·d-1)，每組8只，自由攝食和飲水。每天稱重，實驗組按體重灌胃GSLS，空白組和模型組按照5 ml·kg-1·d-1生理鹽水灌胃。除空白組外，其他組頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1制備亞急性衰老小鼠模型，空白組注射同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃和注射42 d。

1.3胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)于末次給藥后2 h精確稱量小鼠體重，小鼠摘眼球取血而死，冰上分離胸腺和脾臟，在預冷的生理鹽水中漂洗，除去血污，吸水紙吸干后稱重。

1.4淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(體內(nèi)法)〔3〕給藥的第39～41天，各組小鼠每只后肢外側(cè)肌肉處注射植物血凝素0.4 mg。末次給藥后2 h摘眼球取血，以生理鹽水稀釋4倍后制備薄血涂片。自然晾干后用甲醇固定1～3 min，待其自然揮發(fā)后以吉姆薩染液染色30 min，沖洗去多余染液后晾干觀察。油鏡下觀察100個淋巴細胞，計算淋巴母細胞(過渡型細胞計在內(nèi))所占百分比，即淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率。

1.5腹腔巨噬細胞吞噬實驗(半體內(nèi)法)〔4〕給藥的第40、41天，以6%淀粉肉湯腹腔注射。末次給藥后1.5 h腹腔注射1 ml 20%雞紅細胞懸液、揉勻，30 min后取血處死小鼠。消毒腹部，剪開腹壁皮膚，注射2 ml生理鹽水到腹腔中，揉勻后用無針頭注射器吸取腹腔液，約每500 μl滴于一塊載玻片上，每只小鼠備兩塊，置37℃水浴箱中黏附30 min，取出后用預熱的生理鹽水沖洗未被吞噬的雞紅細胞，晾干后同上甲醇固定、吉姆薩染液染色后觀察。油鏡下計數(shù)100個巨噬細胞，按公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及LSD法。

2結(jié)果

2.1GSLS對衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響經(jīng)過不同處置，各組小鼠的胸腺指數(shù)存在區(qū)別(F=5.623，P=0.001)，其中GSLS低劑量組和中劑量組的胸腺指數(shù)高于模型組(P=0.027、0.033)，其他各組差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著差別(F=1.170，P=0.341)。見表1。

2.2GSLS對衰老小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響空白組、模型組及GSLS各劑量組比較，T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率無顯著差別(F=0.895，P=0.477)。見表2，圖1。

2.3GSLS對衰老小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響各組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)存在顯著差異(F=11.506、6.193，P<0.01)。其中，模型組巨噬細胞吞噬率顯著低于空白組(P=0.000)，而GSLS中劑量組小鼠比模型組有明顯提高(P=0.001)。同時，中、低劑量組吞噬指數(shù)也顯著高于模型組(P=0.001、0.008)，表明GSLS對衰老小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力有促進作用。見表2。

表1GSLS對衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

組別胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)空白組1.01±0.163.69±0.54模型組1.00±0.133.36±0.53GSLS低劑量組1.27±0.2631)3.34±0.33GSLS中劑量組1.25±0.351)3.19±0.39GSLS高劑量組0.82±1.683.26±0.64

與模型組比較：1)P<0.05

組別T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(%)巨噬細胞吞噬率(%)巨噬細胞吞噬指數(shù)空白組55.13±15.5492.75±6.963.39±1.46模型組50.06±12.9941.38±16.911)2.36±0.95GSLS低劑量組62.38±10.2143.12±21.775.23±1.492)GSLS中劑量組53.75±12.6276.63±15.822)4.54±2.342)GSLS高劑量組56.25±13.3448.25±27.962.08±1.06

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

圖1　各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞(吉姆薩染色，×1 000)

3討論

免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機體免疫能力的基本指標。其中，胸腺是T淋巴細胞發(fā)育、分化、篩選和成熟的場所〔5〕。本實驗模型主要引起糖代謝紊亂、氧化應激從而模擬衰老〔6〕，而對免疫系統(tǒng)影響不顯著，GSLS可能通過胸腺來優(yōu)化T淋巴細胞質(zhì)量。淋巴細胞的轉(zhuǎn)化實驗是用于檢測其受刺激后增殖能力的，同時實驗中卻發(fā)現(xiàn)，GSLS對淋巴細胞向淋巴母細胞的轉(zhuǎn)化方面并無促進作用。綜合權衡，GSLS對特異性淋巴細胞的作用在于促“質(zhì)”而非增“量”。脾臟指數(shù)提示B淋巴細胞成熟、體液免疫等方面可能并未因GSLS而發(fā)生改變。巨噬細胞是具有多種功能的免疫細胞，作為體內(nèi)的“清道夫”，它們會非特異性的去除體內(nèi)那些損傷死去的細胞以及其他有害成分，也可以“呈遞”抗原，啟動一系列特異性免疫反應。實驗中可以看到，中低劑量給予GSLS可以提高巨噬細胞的反應靈敏度——吞噬比率增高，也可以增強吞噬細胞的吞噬能力——吞噬指數(shù)增大，在非特異免疫方面起到良性作用。這些方面的免疫力提升可能是GSLS能抗機體衰老的重要機制之一。另外，本課題GSLS存在低劑量顯效、長時間加高劑量抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，因此，“久服輕身延年”的服藥方式尚值得商榷。

4參考文獻

1張翼軫，張文駒，穆青，等.人參化學成分的藥理活性及其含量積累的研究進展〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011；39(20)：12158-63.

2楊婷，張沖，陳清軒，等.衰老機制研究進展〔J〕.中國生物工程雜志，2005；25(3)：6-11.

3姜楠，陳琳娜，譚大琦，等.肺炎合劑免疫、抗菌及抗炎作用的實驗研究〔J〕.中國比較醫(yī)學雜志，2005；15(6)：382-6.

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5郭智彬，朱喜科.胸腺發(fā)育與衰老相關基因調(diào)控的研究進展〔J〕.國際免疫學雜志，2011；34(1)：24-7.

6許揚，吳濤，顧佳黎，等.D-半乳糖誘導衰老動物模型研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(13)：1710-3.

〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)