榧樹種子層積過程中主要貯藏物質(zhì)含量及酶活性的變化

李金霞，戴文圣

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

榧樹種子層積過程中主要貯藏物質(zhì)含量及酶活性的變化

李金霞1,2，戴文圣1,2

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

對(duì)2013年10月采自浙江省嵊州市榧樹（Torreya grandis）種子當(dāng)年進(jìn)行層積催芽，通過測定種子胚乳淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)和脂肪含量以及與貯藏物質(zhì)相關(guān)酶類中的淀粉酶、蛋白酶和酸性磷酸酯酶的活性變化，研究其主要貯藏物質(zhì)和相關(guān)酶類的變化規(guī)律。結(jié)果表明：榧樹種子層積150 d后，淀粉含量減少40.30%，蛋白質(zhì)含量減少 57.78%，粗脂肪含量減少 22.45%；可溶性糖含量呈先降低后升高；淀粉酶、蛋白酶、酸性磷酸酶活性在層積處理0 ～ 120 d時(shí)逐漸升高，120 ～ 150d時(shí)略有降低。這說明榧樹種子在層積處理過程中，主要貯藏物質(zhì)在相關(guān)酶類的催化下逐漸分解，為種胚的發(fā)育和種子萌發(fā)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。

榧樹種子；層積；淀粉；可溶性蛋白；粗脂肪；酶活性

榧樹（Torreya grandis）系裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧樹屬（Torreya）一種，分布在我國東部從北亞熱帶到中亞熱帶南緣的皖、浙、蘇、贛、鄂、閩、湘、黔等省的丘陵至中山地帶，其中以皖、浙分布最多[1～4]。榧樹種子目前在生產(chǎn)上主要通過播種育苗，用作培育香榧的嫁接砧木。但由于榧樹種子自然成熟后，尚需經(jīng)過3個(gè)月以上貯藏，達(dá)到生理后熟后才能萌發(fā)[5]，這個(gè)過程對(duì)榧樹育苗具有至關(guān)重要的作用。因此，研究榧樹種子在層積催芽、解除休眠過程中胚乳主要貯藏物質(zhì)含量的變化和相關(guān)酶類的活性，揭示榧樹種子的萌發(fā)機(jī)理，闡明主要貯藏物質(zhì)含量變化與相關(guān)酶活性變化之間的關(guān)系，對(duì)實(shí)現(xiàn)合理調(diào)控種子種胚發(fā)育和種子萌發(fā)進(jìn)程，提高種子萌發(fā)力和整齊度，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

試驗(yàn)所用榧樹種子采于浙江省嵊州市里南鄉(xiāng)屏岫村，海拔500 m，樹齡100 a以上。2013年10月初，在假種皮轉(zhuǎn)呈黃色、部分開裂時(shí)采收。采收后的種實(shí)，放置于陰涼通風(fēng)處，自然堆漚5 d，搓去假種皮，清除雜物，洗凈種子。2013年10月12日，在室外以河沙為材料鋪設(shè)層積床，搭建低、高兩層塑料棚對(duì)種子進(jìn)行層積催芽。之后，經(jīng)常檢查、適時(shí)噴水，保持種沙濕潤、透氣，避免過干、過濕。

1.2 測定內(nèi)容與方法

分別在層積處理后的0、30、60、90、120、130、140、150 d采樣，對(duì)榧樹種子胚乳各生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，重復(fù)三次。主要測定指標(biāo)有：可溶性總糖和淀粉含量，蛋白質(zhì)含量，粗脂肪含量；淀粉酶活性，蛋白酶活性和酸性磷酸酶活性。

具體的測定方法如下：可溶性總糖和淀粉含量的測定采用蒽酮比色法[7]；蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]；粗脂肪含量的測定采用索氏提取法[9]；淀粉酶活性的測定采用3，5 - 二硝基水楊酸比色法[10]；蛋白酶活性的測定采用Folin-酚法[11]；酸性磷酸酶活性的測定采用對(duì)硝基酚磷酸鈉法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用LSD法進(jìn)行多重比較，用Sigma Plot 12.5軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 榧樹種子淀粉和可溶性糖的含量及淀粉酶活性變化

由圖1可知，隨著層積時(shí)間的延長，榧樹種子淀粉含量逐漸減少。層積前榧樹種子淀粉含量為112.79 mg/g，層積150 d時(shí)，其淀粉含量為67.33 mg/g，比層積前減少了40.30%。

從圖1還可看出，隨著層積時(shí)間延長，榧樹種子可溶性糖含量，呈先降低后升高的趨勢。層積前榧樹種子可溶性糖含量為19.54 mg/g，層積90 d，可溶性糖含量降至最低值，為7.80 mg/g，層積150 d時(shí)，可溶性糖含量上升至22.73 mg/g。

圖1 層積過程中榧樹種子淀粉和可溶性糖含量動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Dynamics of starch and soluble sugar content of T.grandis seed during stratification

圖2 層積過程中榧樹種子淀粉酶活性動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamics of amylase activity of T.g randis seed during stratification

由圖 2可看出，隨著層積時(shí)間延長，榧樹種子淀粉酶活性基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢?？偟矸勖富钚栽趯臃e前為1.81 mg·g-1·min-1，層積120 d時(shí)，其活性達(dá)到最大值，為2.28 mg·g-1·min-1，層積150 d時(shí)，為 2.05 mg·g-1·min-1；在整個(gè)層積過程中，α-淀粉酶活性均大于β-淀粉酶，其中，α-淀粉酶在層積前為1.07 mg·g-1·min-1，層積90 d時(shí)，達(dá)到最大值1.22 mg·g-1·min-1，層積120 ～ 130 d，α-淀粉酶變化不大，此后，α-淀粉酶活性逐漸下降，層積150 d時(shí)，其活性降至1.06 mg·g-1·min-1；β-淀粉酶在層積前為0.73 mg·g-1·min-1，層積120d時(shí)，達(dá)到最大值1.16 mg·g-1·min-1，層積130 ～ 140 d，β-淀粉酶活性變化不大，150 d時(shí)下降至0.92 mg·g-1·min-1。

在層積過程中，榧樹種子淀粉含量逐漸降低，淀粉大量分解，為胚的發(fā)育和種子萌發(fā)提供營養(yǎng)?？扇苄蕴呛砍尸F(xiàn)先降低后升高的趨勢，可能與其作為呼吸代謝的底物可直接被利用及種子胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。淀粉酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這說明在層積處理前期，胚乳中的淀粉逐漸被淀粉酶分解為小分子的碳水化合物，供種胚利用完成生理后熟；在層積處理后期，種子淀粉酶活性略降低，這可能與淀粉作為底物的含量減少以及可溶性糖含量的增加有關(guān)。在層積處理過程中，α-淀粉酶活性總體上高于 β-淀粉酶，即在種胚完成生理后熟和種子萌發(fā)的過程中，降解淀粉的酶主要是α-淀粉酶，這在一定程度上說明，在榧樹種子中存在的淀粉主要是直鏈淀粉，或者直鏈淀粉的降解較快，為種子發(fā)育提供主要的糖類營養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 榧樹種子蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性變化

由圖3可知，隨著層積時(shí)間的延長，榧樹種子可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸減少。層積前榧樹種子可溶性蛋白質(zhì)含量為17.22 mg/g，層積150 d時(shí)，其含量為7.27 mg/g，比層積前減少了57.78%。

從圖3還可知，隨著層積時(shí)間的延長，榧樹種子蛋白酶活性呈先升高后逐漸降低的趨勢。層積前榧樹種子蛋白酶活性為1.41 μmol·g-1·h-1，層積120 d時(shí)，達(dá)到最大值，為7.39 μmol·g-1·h-1，層積150 d時(shí)，蛋白酶活性為4.11 μmol·g-1·h-1。

分析表明，在層積過程中，榧樹種子胚乳可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸降低，在層積0～120d時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量降低幅度較大，在層積120～150 d時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)降低幅度減緩；與此同時(shí)，蛋白酶的活性呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢，這與蛋白質(zhì)的變化相一致。這說明，在層積處理前期，種胚發(fā)育需要胚乳提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下開始降解，在層積處理后期，胚根已經(jīng)突破種皮，蛋白質(zhì)含量顯著減低，從胚乳內(nèi)部獲取營養(yǎng)物質(zhì)的需求減弱，蛋白酶活性降低。

2.3 榧樹種子粗脂肪含量和酸性磷酸酯酶活性變化

由圖4可知，隨著層積時(shí)間的延長，榧樹種子粗脂肪含量逐漸減少。層積前榧樹種子粗脂肪含量為50.55%，層積150 d時(shí)，粗脂肪含量為39.20%，比層積前減少了22.45%。

由圖4還可以看出，隨著層積時(shí)間的延長，榧樹種子酸性磷酸酯酶活性呈先升高后降低的趨勢。層積前榧樹種子酸性磷酸酯酶活性為63.68 nmol·mg-1·min-1，層積120 d時(shí)達(dá)到最大值，為130.92 nmol·mg-1·min-1，層積150 d時(shí)，酸性磷酸酶酯活性為94.91 nmol·mg-1·min-1。

圖3 層積過程中榧樹種子蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性動(dòng)態(tài)變化Figure 3 Dynamics of protein content and its activity ofT. grandis seed during stratification

圖4 層積過程中榧樹種子粗脂肪含量和酸性磷酸酯酶活性動(dòng)態(tài)變化Figure 4 Dynamics of crude fat content and acid phosphataseactivityof T. grandisseed during stratification

分析表明，在層積過程中，榧樹種子粗脂肪含量逐漸降低，脂肪分解轉(zhuǎn)化為種胚可直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)，為層積后期種子的萌發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；酸性磷酸酯酶活性在層積處理處理前期逐漸升高，在層積處理后期其活性逐漸降低，這與粗脂肪含量的降解相一致。

3 結(jié)論與討論

在榧樹種子層積過程中，通過對(duì)種子胚乳淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)和脂肪以及與貯藏物質(zhì)相關(guān)酶類中的淀粉酶、蛋白酶和酸性磷酸酯酶的測定分析得出：①榧樹種子在層積過程中，胚乳中的淀粉、粗脂肪含量逐漸降低，貯藏物質(zhì)進(jìn)行降解，轉(zhuǎn)化為可溶性的各種物質(zhì)，可為胚的發(fā)育成熟和種子萌發(fā)提供能量，這與南方紅豆杉種子層積處理的結(jié)果相一致[14～15]；②榧樹種子蛋白質(zhì)含量在層積過程中逐漸降低，這與王家源等[16]對(duì)青錢柳種子以及戴萍[17]對(duì)光皮樹種子的研究結(jié)果相一致；③榧樹種子可溶性糖含量在層積過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與黃儒珠等[18]、李秋琦等[19]對(duì)南方紅豆杉，廖云嬌等[20]對(duì)東北紅豆杉的研究結(jié)果不同，可能與前人采用變溫層積和化學(xué)試劑浸種有一定關(guān)系；④榧樹種子淀粉酶和蛋白酶在層積過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與李生平[21]對(duì)銀杏種子的研究結(jié)果相一致；⑤榧樹種子層積處理120 d時(shí)，酸性磷酸酶活性達(dá)到最大，而張艷杰[14]對(duì)南方紅豆杉種子的研究中，酸性磷酸酯酶的變化無明顯的規(guī)律性。

層積處理是解除種子休眠常用的方法，在理論研究和實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，榧樹種子在萌發(fā)過程中的代謝復(fù)雜，要真正揭示種子胚乳中貯藏物質(zhì)的分解、各代謝途徑的調(diào)控以及能量代謝與種子完成生理后熟、進(jìn)一步萌發(fā)之間的相互關(guān)系，尚需進(jìn)一步深入研究。在榧樹種子層積催芽過程中，各內(nèi)源激素的含量變化以及激素之間的相互作用等問題也有待進(jìn)一步研究。

建議今后在開展類似研究中，需要注意以下幾個(gè)問題：（1）進(jìn)行層積的榧樹種子，盡可能保證種子成熟度一致，要充分成熟采收，且處理及時(shí)，層積方法得當(dāng)，保持試驗(yàn)材料的一致性；（2）在對(duì)榧樹種子的貯藏物質(zhì)、酶類和內(nèi)源激素等相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定分析時(shí)，最好選擇榧樹生長結(jié)實(shí)正常的年份采樣作試材，或進(jìn)行2 ～ 3 a的連續(xù)觀測其穩(wěn)定性，盡可能減少立地條件、天氣狀況（如長時(shí)間的高溫、干旱或者雨量過大等）和管理措施等環(huán)境條件對(duì)種子生長和成熟的影響，降低種子自身“大小年”對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

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Storage Substance Content and Their Enzyme Activity During Stratification of Torreya grandis Seed

LI Jin-xia1,2，DAI Wen-sheng1,2
（1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. School of Forestry and Bio-technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Seeds of Torreya grandis were collected in the Oct., 2013 in Shengzhou, Zhejiang province, and were stratified on the same month. Determinations were made on content of starch, soluble sugar, protein, fat, activities of amylase, protease, acid phosphatase. The results demonstrated that 150 days later, the content of starch, protein and crude fat of treated seeds decreased by 40.30%, 57.78% and 22.45% respectively, while the content of soluble sugar decreased first and then increased. The activity of amylase, protease and acid phosphatase increased from 0 to 120th days, and slightly decreased from 120th to 150th days of the stratification. The experiment indicated that the storage substances decomposed under the catalysis of relative enzymes for providing energy of embryo development and seed germination.

seeds of Torreya grandis; stratification; starch; protein; crude fat; enzyme activity

S722.1+4

A

1001-3776（2015）05-0037-04

2015-02-03；

2015-05-16

浙江省重點(diǎn)科技專項(xiàng)（2012C12904-12）

李金霞（1988-），女，河南焦作人，碩士，從事經(jīng)濟(jì)林培育與利用研究；*通訊作者。