黑蘇嘎－25對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素－1β表達(dá)的影響

黑蘇嘎-25對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響

佟淑平孫志剛杜聞博王洪軍李立飛田小東丁海東

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼028000)

摘要〔〕目的探討黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法取清潔級(jí)健康Wistar大鼠60只，分為假手術(shù)組、模型組、黑蘇嘎-25低、中、高劑量組，用藥組動(dòng)物灌胃給藥7 d，制備局灶性腦缺血再灌注(MCAO)大鼠模型，通過行為學(xué)判斷神經(jīng)功能缺損評(píng)分、組織病理學(xué)測定腦梗死面積、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清中腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β水平。結(jié)果黑蘇嘎-25能減少M(fèi)CAO大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死的面積，降低局灶性腦缺血后血清TNF-α、IL-1β水平。結(jié)論黑蘇嘎-25對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低血清TNF-α、IL-1β含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕蒙藥；黑蘇嘎-25；腦缺血再灌注損傷

中圖分類號(hào)〔〕R74〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古民族大學(xué)研究項(xiàng)目(NMD1184)

通訊作者：杜聞博(1981-),男,碩士，主要從事腦血管病學(xué)研究。

第一作者：佟淑平(1978-),女，碩士，主要從事肺間質(zhì)性疾病研究。

缺血性腦血管病(ICVD)的防治一直是神經(jīng)病學(xué)的難點(diǎn)和重點(diǎn)〔1，2〕，目前治療的關(guān)鍵是盡早溶栓治療恢復(fù)缺血腦細(xì)胞、組織血液灌流，一方面可挽救瀕臨死亡的腦細(xì)胞，但另一方面也會(huì)加重腦細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡，也就是說缺血后的血流再灌注在某些情況下會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞、組織損傷和功能障礙，造成腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷(CIRI)是由于血流再灌注后引起的繼發(fā)性損傷，是目前最受關(guān)注的問題之一〔3〕，越來越多學(xué)者研究關(guān)于CIRI機(jī)制中腦組織缺血后的炎癥反應(yīng)〔4〕。因此通過各種有效措施阻斷腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)可減少缺血性神經(jīng)元損傷〔5〕。蒙藥黑蘇嘎-25主治脈病、偏癱、半身不遂等臨床療效顯著，主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。黑蘇嘎-25成分是從天然產(chǎn)物中提取，具有副作用小且作用多途徑、多靶點(diǎn)，可針對(duì)腦缺血性變化的多個(gè)環(huán)節(jié)。本文探討黑蘇嘎-25對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠CIRI的保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、主要藥品、試劑及儀器選用健康雄性Wistar大鼠60只，體重約(230±20)g，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼：SCXK(吉)-2011-0004。大鼠飼養(yǎng)于適宜溫度及濕度的動(dòng)物室中，處于相同飼養(yǎng)環(huán)境且自由攝食和飲水，自然晝夜(術(shù)前12 h禁食水)。黑蘇嘎-25 (0.2 g/粒，內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn))；TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國進(jìn)口分裝)；紅四氮唑(TTC)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司。手術(shù)顯微鏡(吉祥鳥牌，江蘇鎮(zhèn)江中文光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭)；醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(BI-2000成都泰盟科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組60只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成五組，每組12只。假手術(shù)組：假手術(shù)+生理鹽水灌胃；模型組：缺血再灌注+生理鹽水灌胃； 治療組高、中、低劑量黑蘇嘎-25組：缺血再灌注+高、中、低劑量黑蘇嘎-25灌胃。

1.2.2給藥方法假手術(shù)組：生理鹽水5 ml·kg-1·d-1；模型組：生理鹽水5ml·kg-1·d-1；高、中、低劑量黑蘇嘎-25組：360、180、90 mg·kg-1·d-1，溶于和假手術(shù)組等體積的生理鹽水，用前搖勻。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.3CIRI模型的制備模型組與用藥組Wistar大鼠于最后1次灌胃后2 h參照Longa等〔6〕的改良的線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型：用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定，用醫(yī)用碘伏消毒頸前部，在頸正中行長約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和分叉部，分離分叉處的頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，分離ECA分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，依次結(jié)扎CCA近心端、支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，并在遠(yuǎn)心端剪斷枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，在甲狀腺上動(dòng)脈分支之后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，自中間剪斷。拉直近心端剪斷的ECA，使ECA與ICA處于同一直線上，微動(dòng)脈夾暫時(shí)性夾閉ICA遠(yuǎn)心端，于ECA距CCA分叉5 mm處附近，在ECA剪一“V”口，將線栓向頸內(nèi)動(dòng)脈顱方向插入16～18 mm(線栓直徑0.24 mm，頭端0.30 mm)注意不要誤入翼腭動(dòng)脈，可感到阻力而無法向前推進(jìn)時(shí)停止，將線栓固定在ECA上，縫合手術(shù)切口，栓線尾部伸出皮下1 cm左右便于拔栓線，缺血2 h后，外拉栓線0.5 cm，從而實(shí)現(xiàn)24 h再灌注。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，其余不做任何處理。模型成功的標(biāo)志是大鼠左眼出現(xiàn)Horner征；提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲；爬行時(shí)向右側(cè)傾倒或按順時(shí)針方向轉(zhuǎn)圈，不成功者予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.4標(biāo)本的收集與處理假手術(shù)組在手術(shù)后2 h，其余各組模型制備成功后，再達(dá)到各自再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，經(jīng)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，腹主動(dòng)脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進(jìn)行左心室灌流固定，至流液透明，斷頭取腦，行TTC染色，測定腦梗死體積。

1.2.5神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照Longa等〔6〕的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)麻醉蘇醒后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。0分、4分或死亡剔除，再隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.6腦梗死體積測定(TTC染色法)假手術(shù)組在術(shù)后2 h，其余各組在模型制備成功后，達(dá)到各再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進(jìn)行左心室灌流固定，至流液透明，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余用排刀冠狀切成8片，每片厚度約2 mm，置于2%TTC溶液中，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光染色30 min，4%多聚甲醛液中固定24 h后數(shù)碼相機(jī)照片后，用醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(BI-2000成都泰盟科技有限公司)處理照片，測量腦梗死面積，計(jì)算腦梗死體積比，其與全腦體積之比為梗死體積百分比。

1.2.7血清TNF-α、IL-1β水平的表達(dá)假手術(shù)組在術(shù)后2 h，其余各組在模型制備成功后，達(dá)到各再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 ml，在4℃冰箱內(nèi)沉淀24 h后，3 000 r/min離心10 min留取上清液，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分腦缺血2 h，再灌注24 h后，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀主要表現(xiàn)為提尾時(shí)右前肢內(nèi)屈曲收，肌力、肌張力降低，側(cè)推阻力降低，活動(dòng)減少，向右側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈，伴或不伴有左側(cè)Horner征。假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分均為0分；與假手術(shù)組相比，模型組及黑蘇嘎-25治療組均有明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損程度均有所減輕，并隨著藥物劑量的增加，神經(jīng)功能缺損評(píng)分減少，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表1。

2.2黑蘇嘎-25對(duì)大鼠CIRI腦梗死體積的影響假手術(shù)組腦組織呈均勻紅色無梗死灶；模型組和黑蘇嘎-25組可見梗死蒼白區(qū)域位右側(cè)額頂葉皮質(zhì)下部和紋狀體外側(cè)區(qū)。與假手術(shù)組相比，模型組及黑蘇嘎-25高、中、低劑量組均有明顯的白色梗死灶(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量均使梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表1。

2.3黑蘇嘎-25對(duì)大鼠CIRI血清TNF-α水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組及黑蘇嘎-25各劑量組血清TNF-α水平的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量組均使血清TNF-α水平降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表2。

2.4黑蘇嘎-25對(duì)大鼠CIRI損傷血清中IL-1β的影響與假手術(shù)組相比，模型組及黑蘇嘎-25各劑量組血清中IL-1β水平的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量均使血清中IL-1β水平的表達(dá)降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表2。

表1　腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分及

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2　腦缺血再灌注后血清TNF-α、IL-1β水平的

3討論

溶栓、抗血小板和抗凝治療后，在血流復(fù)通實(shí)施再灌注的同時(shí)，又會(huì)在某些情況下(如炎癥反應(yīng))加重已缺血細(xì)胞、組織的進(jìn)一步損傷〔7〕。通過藥物干預(yù)等方法減輕這種損傷程度，可達(dá)到較為理想的治療目的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組在缺血2 h，再灌注24 h后，形成了再灌注損傷，表現(xiàn)為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，腦組織出現(xiàn)梗死灶及血清TNF-α、IL-1β水平升高；黑蘇嘎-25治療后，神經(jīng)功能缺損有所減輕，梗死灶體積縮小，血清TNF-α、IL-1β水平降低，達(dá)到了藥物干預(yù)的保護(hù)作用。蒙藥民間有許多成方可以治療缺血性腦血管疾病，但蒙醫(yī)臨床上最常用的只有三種：珍寶丸、扎沖十三味和黑蘇噶-25，這三種藥中黑蘇噶-25研究的最少，可能與藥物成分多，利用現(xiàn)代工藝難以提取有效成分，而且價(jià)格昂貴有關(guān)。參照《中國藥典》2005年版，蒙藥黑蘇嘎-25，性味咸寒，具有解毒，愈傷，除協(xié)日烏素，清腦退翳，主治白脈病，中風(fēng)，偏癱、半身不遂腦傷，協(xié)日烏素病，眼翳白斑，骨折，創(chuàng)傷，頸強(qiáng)等功效〔8〕。本實(shí)驗(yàn)通過藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算表，根據(jù)人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量。

研究表明腦缺血早期TNF-α的表達(dá)迅速增加是腦梗死形成的主要原因〔9〕，郭順華等〔10〕用Northern印跡方法觀察到在缺血后1 h缺血側(cè)神經(jīng)元即有TNF-α mRNA的表達(dá)，24 h達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦缺血再灌注過程中TNF-α的水平增加；黑蘇嘎-25能減少血清TNF-α的水平，對(duì)腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護(hù)作用。IL-1β導(dǎo)致血栓形成，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、自由基等促進(jìn)腦缺血后炎癥介質(zhì)的損傷作用，引起神經(jīng)元損傷。IL-1β還能增加細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1在腦缺血中的表達(dá)水平。ICAM-1可使介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密黏附，阻塞微血管，降低腦血流。

本研究顯示黑蘇嘎-25的應(yīng)用明顯改善了腦缺血的神經(jīng)損傷程度及減少了腦梗死灶體積，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可能是抑制了TNF-α及IL-1β活性而產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕，從而減輕腦缺血再灌注所造成的神經(jīng)功能損傷。因以上用藥劑量是根據(jù)人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量，并以此標(biāo)準(zhǔn)確定為大鼠用藥的中劑量治療組，如果把此標(biāo)準(zhǔn)確定為低劑量治療組，也就是說增加用藥劑量，其治療效果有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明黑蘇嘎-25能夠減少局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，降低局灶性腦缺血后血清TNF-α、IL-1β水平，抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)，可能參與了黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦保護(hù)作用。

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〔2014-01-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)