日本血吸蟲SjCHGC06822蛋白誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫保護效果觀察

段明明，劉 群,2，葛 程,2，苑純秀，陸 柯，李 浩，馮新港

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

·研究論文·

日本血吸蟲SjCHGC06822蛋白誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫保護效果觀察

段明明1，劉 群1,2，葛 程1,2，苑純秀1，陸 柯1，李 浩1，馮新港1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

利用PCR技術(shù)擴增日本血吸蟲SjCHGC06822 ORF全長序列，以pET28a(+)為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達，His-Ni柱層析純化rSjCHGC06822/His蛋白后，生物信息學分析其可能結(jié)構(gòu)，Western blot分析其抗原性。利用重組蛋白免疫BALB/c小鼠評估其免疫效果，ELISA分析血清抗體亞型變化。結(jié)果顯示，獲得日本血吸蟲SjCHGC06822的完整ORF序列591 bp，編碼192個氨基酸，序列aa37～aa72含一個EF-hand手性域結(jié)構(gòu)，無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)。獲得的SjCHGC06822/His重組蛋白具有較好的抗原性，在2次獨立BALB/c小鼠實驗中，與PBS對照組相比，SjCHGC06822/His蛋白免疫組誘導(dǎo)小鼠獲得30.36%、40.26%減蟲率和30.14%、12.28%肝臟減卵率，血清IgG抗體免疫及感染后持續(xù)增高，IgG2a和IgG1水平隨免疫次數(shù)增高，感染后出現(xiàn)下降，但IgG2a/IgG1（＜1）水平持續(xù)增加。本研究成功克隆了SjCHGC06822基因，并成功表達純化了rSjCHGC06822/His蛋白，且免疫原性和反應(yīng)原性良好。SjCHGC06822蛋白免疫可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生一定的保護力，誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答更偏向于Th1型。

日本血吸蟲；SjCHGC06822；免疫原性；Th1應(yīng)答

體被是血吸蟲童蟲、成蟲與宿主直接接觸結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，包括日本血吸蟲在內(nèi)的一些蠕蟲，如曼氏血吸蟲[1]、大片吸蟲[2]、肝片吸蟲[3]以及華支睪吸蟲[4]等，其體被結(jié)構(gòu)中存在一類含有EF-hand結(jié)構(gòu)域蛋白。這類蛋白的EF-hand結(jié)構(gòu)域中包含一種鈣結(jié)合位點的螺旋-中央環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，主要生物學功能與細胞鈣離子相關(guān)吸蟲表膜中存在的蛋白類似[5]。研究表明這些含EF-hand手性域的分子可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的抗血吸蟲免疫病理保護，而其免疫調(diào)節(jié)機制仍不清楚[6-8]。查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲EF-hand手性分子SjCHGC06822分子可能通過抗原提呈細胞（antigen presenting cell, APC）提呈活化不同的CD4+T細胞，進而調(diào)節(jié)日本血吸蟲肝臟蟲卵肉芽腫炎癥反應(yīng)。本研究克隆表達了SjCHGC06822分子，對其進行生物信息學分析，Western blot檢測該分子免疫原性，并利用重組蛋白免疫BALB/c小鼠建立肉芽腫炎癥調(diào)節(jié)模型，評估其免疫保護效應(yīng)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 主要試劑Ex Taq聚合酶、T4 ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、小型質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA片段純化試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；DNA Marker購自北京天根生物科技有限公司；蛋白分子量Marker購自麥約爾生物技術(shù)有限公司；Odyssey辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG購自上海儀濤生物有限公司；辣根過氧化物酶標記的山抗小鼠IgG、IgGa、IgG1購自武漢三鷹生物有限公司；Ni-NTA His·Bind 樹脂、Ni-NTA緩沖液試劑盒購自Novagen公司。 E.coli DH5α感受態(tài)細胞、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京天根生物科技有限公司；BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物公司；尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；pET28a(+)、不同期別天然蟲體蛋白、感染日本血吸蟲42 d小鼠血清由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸

1.2 菌種、實驗動物醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室保存或制備。

1.3 SjCHGC06822基因的克隆根據(jù)GenBank已注冊序列（GenBank登錄號：ACE06906.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。上游引物：5′-GC GCGGATCCATGGCGAGTACAATGG-3′，5′端加入保護堿基和BamHⅠ酶切位點，下游引物：5′-CG CGCTCGAGTTAATTGTTTGGTGTAC-3′，3′端加入XhoⅠ酶切位點。以上引物均由上海Invitrogen公司合成。以42日齡蟲體cDNA為模板，擴增全長SjCHGC06822 ORF序列。擴增體系：Ex Taq酶0.5 μL、上下游引物各0.5 μL（50 pmol/μL）、42日齡成蟲cDNA模板1 μL（100 ng）、dNTP mix 8 μL、10×Ex Taq buffer 5 μL、滅菌ddH2O 33.5 μL，PCR程序設(shè)定：94℃ 5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延長2 min，35個循環(huán)；最72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按膠回收試劑盒說明進行切膠回收純化。

1.4 pET28a(+)-SjCHGC06822/DH5α克隆載體構(gòu)建PCR純化產(chǎn)物和pET28a(+)經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ37℃水浴雙酶切5 h，片段純化后亞克隆至pET28a(+)。連接體系：目的片段15 μL、pET28a (+) 5 μL、T4 ligase 1 μL、10×T4 ligase buffer 2 μL，16℃水浴連接17 h。重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將連接產(chǎn)物5 μL與100 μL DH5α混合冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰浴2 min后加入800 μL LB培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)45 min。取200 μL涂于卡納抗性LB培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單個陽性菌落，進行菌液鑒定。鑒定體系：Es Taq Master Mix 12.5 μL、上游引物 0.5 μL、下游0.5 μL、菌液1.5 μL、ddH2O 10 μL。PCR程序同1.3。鑒定得到的陽性菌液送上海桑尼公司測序。將菌液鑒定和測序均陽性的pET28a(+)-SjCHGC06822/DH5α按1∶100接種于含1 mmol/L 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/ min培養(yǎng)14 h，按TaKaRa質(zhì)粒抽取試劑盒說明抽取質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ37℃水浴雙酶切5 h，2%瓊脂糖凝膠檢測雙酶切結(jié)果。

1.6 生物信息學分析利用在線分析軟件ExPAsy Compute pI/Mw tool（http∶//web.expasy.org/compute_ pi/），預(yù)測SjCHGC06822蛋白大小及其等電點。利用在線軟件TMHMM Server v 2.0（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析SjCHGC06822蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP 4.1 Server（http∶//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測是否含有信號肽，ScanProsite tool（http∶//prosite.expasy.org/scanprosite/）分析其可能結(jié)構(gòu)。

1.7 大腸桿菌中表達將pET28a(+)-SjCHGC06822質(zhì)粒導(dǎo)入BL21（DE3），構(gòu)建pET28a(+)- SjCHGC06822/ BL21表達克隆，方法同1.4。接種含1 mmol/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)，并不斷測定OD600值。OD600值達到1時，加入終濃度為1 mmol/L 的 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，溶于binding buffer，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。選取陽性表達克隆菌，接種500 mL LB培養(yǎng)基，同樣方法收集菌體，溶于binding buffer，溶液反復(fù)凍融3次后，超聲裂解菌體，10 800×g離心收集上清與沉淀，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。上清用Ni-NTA His●Bind 樹脂純化，濾去25%乙醇，依次用3倍體積滅菌去離子水、5倍鎳離子化緩沖液、3倍體積binding buffer平衡柱體，加1～2倍體積樣品，4℃孵育30 min，10倍體積binding buffer平衡，6倍體積washing buffer漂洗，4倍體積eluting buffer洗脫，分段收集，SDS-PAGE電泳檢測純化rSjCHGC06822蛋白。將目的蛋白透析至1×PBS，濃縮后，SDSPAGE電泳檢測，改良BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后分裝保存于-20℃。

1.8 多抗制備調(diào)整rSjCHGC06822蛋白濃度至500 mg/mL，按46∶54比例與206佐劑充分混合，多點免疫6 周齡BALB/c小鼠，每只200 μL。連續(xù)免疫3次，每次間隔2 w。第3次免疫后眼眶采血，-80℃保存。

1.9 Western blot分析rSjCHGC06822蛋白的免疫原性rSjCHGC06822蛋白和不同期別的可溶性成蟲蟲體蛋白分別經(jīng)SDS-PAGE電泳（固定電流0.2 A、2 h）后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖（NC）維膜上，1×PBS沖洗，5% 脫脂奶粉4℃過夜封閉，PBST洗3次，每次5 min；以感染日本血吸蟲42日齡小鼠血清和rSjCHGC06822蛋白免疫42日齡小鼠血清分別1∶100稀釋后作為一抗，與NC膜室溫孵育 3 h，1×PBS洗3次，每次5 min；Odyssey辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG1∶15 000稀釋后作為二抗，室溫避光與NC膜孵育40 min，PBST洗3次，PBS洗2次，每次5 min。Odssy雙色紅外激光掃描儀檢測。

2.0 小鼠免疫保護實驗選12只BALB/c雌鼠，隨機分2組，每組6只，分別為rSjCHGC06822/His蛋白免疫組與 PBS 對照組。蛋白免疫組每次注射rSjCHGC06822/His蛋白-ISA 206佐劑乳化液（46∶54），PBS對照組每次注射同體積PBS-ISA 206佐劑乳化液（46∶54）。首次免疫蛋白50 μg，二次免疫和三次免疫量減半，每次間隔時間2 周。三免后10 d腹部貼片法感染(40±1)條日本血吸蟲尾蚴，感染后42 d剖殺，肝門靜脈法收集蟲體計數(shù)。分別收集各組小鼠肝臟稱重后加入20 mL PBS，高效組織勻漿儀勻漿后取1 mL，加入1 mL 10%NaOH混勻，56℃水浴鍋消化30 min，蟲卵計數(shù)，每份樣品計3次，取平均數(shù)，最后換算成每克肝臟荷蟲卵數(shù)（egg per gram,EPG）。實驗組小鼠分別在一次免疫后7 d、二次免疫后7 d、三次免疫后7 d、感染14 d后和感染42 d后眼眶采血，分離血清，常規(guī)ELISA法檢測IgG、IgG2a和IgG1抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 SjCHGC06822基因克隆及pET28a(+)-SjCHGC06822/DH5α克隆載體構(gòu)建根據(jù)GenBank中已載入序列設(shè)計引物，并加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，以42日齡日本血吸蟲cDNA為模板，PCR克隆得到一段大小為591 bp片段，經(jīng)酶切純化連接至pET28a (+) 質(zhì)粒，導(dǎo)入DH5α，雙酶切鑒定及測序比對，證明擴增序列及插入位置和方向正確，pET28a (+)- SjCHGC06822/DH5α克隆載體構(gòu)建成功。

2.2 SjCHGC06822基因生物信息學分析結(jié)果ExPAsyCompute pI/Mw tool分析結(jié)果顯示：SjCHGC06822基因編碼196個氨基酸，預(yù)計分子量大小22.98 kDa，等電點7.67。ScanProsite 分析顯示SjCHGC06822 在aa37～aa72處有一個明顯的EF-hand 結(jié)構(gòu)域，SignalP4.1 Server在線分析顯示SjCHGC06822分子無信號肽結(jié)構(gòu)，TMHMM Server v 2.0分析顯示SjCHGC06822分子無跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 SjCHGC06822基因的PCR擴增(A)及重組 pET28a(+)-SjCHGC06822的雙酶切鑒定(B)Fig.1 The application of SjCHGC06822 gene by PCR(A) and the restriction enzyme analysis of recombinant pET28a(+)-SjCHGC06822 plasmid(B)

2.3 pET28a(+)-SjCHGC06822在大腸桿菌中的表達與重組蛋白純化結(jié)果重組質(zhì)粒pET28a(+)-SjCHGC06822導(dǎo)入BL21(DE3)大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示23 kDa處有明顯過表達帶，與預(yù)期蛋白大小相符（圖2）。經(jīng)Ni-NTA His●Bind 樹脂純化得到rSjCHGC06822/His蛋白。

圖2 rSjCHGC06822蛋白的原核表達（A）和rSjCHGC06822蛋白的純化（B）Fig.2 Expression of rSjCHGC06822 protein（A）and purifi cation of rSjCHGC06822 protein（B）

2.4 rSjCHGC06822蛋白免疫原性鑒定以感染日本血吸蟲42日齡小鼠血清為一抗對純化的重組蛋白rSjCHGC06822/His進行Western blot分析，結(jié)果在23 kDa處有明顯識別帶；以rSjCHGC06822蛋白制得抗血清為一抗，分別對42、35、23、14、10日齡蟲體可溶性蛋白進行Western blot分析，同樣在23 kDa處同樣有明顯識別帶（圖3）。結(jié)果表明rSjCHGC06822蛋白具有較強的免疫原性，在不同期別童蟲及成蟲中有表達。

2.5 小鼠免疫試驗結(jié)果統(tǒng)計2次獨立實驗的減蟲率和減卵率結(jié)果見表1。與PBS對照組相比，rSjCHGC06822/His蛋白免疫誘導(dǎo)了30.36%、40.26%的減蟲率（P＜0.01）和30.14%、12.28%（P＜0.01）的肝臟減蟲卵率。

圖3 Western blot 分析rSjCHGC06822/His蛋白免疫原性和反應(yīng)原性Fig.3 Immunogenicity and reactogenicity analysis of rSjCHGC06822/His protein by Western blot

表1 rSjCHGC06822/His蛋白誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫保護結(jié)果Tabel 1 Evaluation of protective effi cacy of rSjCHGC06822/His protein in BALB/c mice

2.6 血清抗體水平結(jié)果表明rSjCHGC06822/His蛋白免疫能夠誘導(dǎo)高水平的IgG抗體（見圖4)。同時rSjCHGC06822/His蛋白免疫組IgG2a 和IgG1水平隨著免疫次數(shù)增加而增加，但是攻擊感染后二者水平呈下降趨勢。值得注意的是IgG2a在感染d14出現(xiàn)顯著的增高。另外，PBS佐劑對照組中IgG2a/IgG1比值呈免疫過程中減小感染后增加的“波谷”狀變化，而rSjCHGC06822/His蛋白免疫組中，整個過程IgG2a/IgG1比值緩慢增加，感染d14與免疫過程相比增加尤為明顯（P＜0.01）（圖5）。

圖4 ELISA檢測不同免疫組BALB/c小鼠血清抗SjCHGC06822/His IgG、IgG2a和IgG1抗體水平變化(**表示P＜0.01)Fig.4 Analysis of anti- SjCHGC06822/His IgG, IgG2a and IgG1 antibody levels in BALB/c mice serum by ELISA (**means P＜0.01)

圖5 ELISA檢測不同免疫組BALB/c小鼠血清抗SjCHGC06822/His IgG2a/IgG1抗體水平變化(#、**表示P＜0.01 )Fig.5 Analysis of anti- SjCHGC06822/His IgG2a/ IgG1 antibody levels in BALB/c mice serum by ELISA (#,**mean P＜0.01 )

3 討論

體被蛋白是血吸蟲與宿主之間直接相互作用分子，參與血吸蟲的營養(yǎng)吸收、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及自身穩(wěn)態(tài)的維護，更重要的是直接參與血吸蟲與宿主之間的免疫作用，如免疫逃避、免疫調(diào)節(jié)。EF-hand結(jié)構(gòu)域蛋白是血吸蟲和一些蠕蟲體被特有蛋白，已報道的Sm21.7、Sm21.6、SjTP22.4共同含有EF-hand結(jié)構(gòu)域[6-8]，這些蛋白分子免疫小鼠可不同程度的減小蟲卵肉芽腫的病理損傷。因此我們選擇對日本血吸蟲SjCHGC06822分子進行研究，以期為相似蛋白分子篩選和鑒定提供科學依據(jù)。

本研究對日本血吸蟲SjCHGC06822基因進行了克隆，構(gòu)建了pET28a(+)- SjCHGC06822重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中成功表達得到約23 kDa重組蛋白，免疫原性和反應(yīng)原性顯示rSjCHGC06822可以作為抗原用于動物實驗。重組蛋白免疫小鼠制得多克隆抗體能夠識別不同期別的蟲體蛋白，推斷SjCHGC06822分子在童蟲及成蟲期均有表達。而Liu等[9]基于蛋白質(zhì)組分析顯示日本血吸蟲SjCHGC06822蛋白在尾蚴期呈現(xiàn)高表達，而在童蟲期、成蟲期及蟲卵中表達較低，這點需要進一步的驗證。

兩次動物保護試驗顯示，SjCHGC06822蛋白免疫能夠起到一定的減蟲和肝減卵作用，并且在誘導(dǎo)蟲卵肉芽腫炎癥浸潤模型中，rSjCHGC06822/His蛋白免疫組能夠募集到更多的炎性細胞（數(shù)據(jù)未顯示），整體反應(yīng)過程呈急性反應(yīng)。血清抗體水平分析表明，SjCHGC06822蛋白免疫小鼠能夠誘導(dǎo)高水平的IgG抗體，可能與宿主的殺蟲作用有關(guān)。

同時，抗體亞型監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，IgG2a 和IgG1水平隨著免疫次數(shù)增加而增加，但是攻擊感染后二者水平呈下降趨勢。值得注意的是IgG2a在感染d 14出現(xiàn)顯著增高，我們推測感染誘導(dǎo)宿主免疫迅速出現(xiàn)偏向Th1型的應(yīng)答。Th1型免疫應(yīng)答往往啟動早期的急性感染過程，其作用在于阻止童蟲的遷移和成蟲的成熟[10]。而血吸蟲蟲卵肉芽腫的病理基礎(chǔ)是基于蟲體或蟲卵抗原刺激宿主免疫系統(tǒng)，引發(fā)的由CD4+T細胞介導(dǎo)的，蟲卵周圍大量的炎性細胞浸潤為特征的超敏反應(yīng)[11,12]。rSjCHGC06822/His蛋白免疫組中，與免疫過程相比，感染后d14 IgG2a/IgG1比值增加明顯（P＜0.01），即感染初期rSjCHGC06822/His蛋白誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答更偏向于Th1型，這可能是SjCHGC06822蛋白免疫組能夠募集到更多的炎性細胞和具有一定減蟲卵作用的重要原因。

本研究成功克隆了SjCHGC06822基因，并成功表達純化了rSjCHGC06822/His蛋白，且免疫原性和反應(yīng)原性良好。SjCHGC06822蛋白免疫可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生一定的保護力，且誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答更偏向于Th1型，為進一步研究該蛋白調(diào)節(jié)蟲卵肉芽腫炎癥過程鑒定基礎(chǔ)。

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IMMUNE PROTECTIVE RESPONSE OF RECOMBINANT SJCHGC06822 PROTEIN AGAINST SCHISTOSOMA JAPONICUM

DUAN Ming-ming1, LIU Qun1,2, GE Cheng1,2, YUAN Chun-xiu1, LU Ke1, LI Hao1, FENG Xin-gang1
(1.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The present study aimed at obtaining the recombinant SjCHGC06822 protein by using prokaryotic expression system and evaluating the immune response in BALB/c mice.A full-length ORF encoding SjCHGC06822 of S.japonicum was amplifi ed in PCR.The obtained cDNA was subcloned into pET28a(+) vector that was then transformed into BL21(2E).The recombinant protein was purifi ed using His-Ni resin.Bioinformatics analysis showed that the full-length ORF was 591 bp, encoding 192 amino acids.The SjCHGC06822 protein had an EF-hand domain without signal peptide and transmembrane peptide.The recombinant protein was visualized as a band at molecular mass of 23 kDa in Western blot.BALB/c mice were immunized with the recombinant protein and antibody responses were detected in ELISA.The immunized mice along with non-immunized controls were challenged with S.japonicum and worm reduction rate and liver egg reduction were recorded.In two separate animal experiments, worm reduction rates of the immunized mice were 30.36% and 40.26% and liver egg reductions were 30.14% and 12.28%.The specifi c IgG, IgG2a and IgG1 were detected using ELISA.The antibody responses gradually increased post immunization and subsequent challenge.However, IgG2a and IgG1 levels increased post immunizationbut decreased post challenge while the ratio of IgG2a/IgG1 (＜1) was climbing.In conclusion, the recombinant SjCHGC06822 protein can induce good immunogenicity.

Schistosoma japonicum; SjCHGC06822; immunogenicity; Th1 type response

S852.735

：A

：1674-6422（2015）01-0039-08

2014-04-17

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目

段明明，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學專業(yè)

馮新港，E-mail：boming666@163.com