補腎健脾、扶正祛邪中藥在荷瘤小鼠化療過程中的減毒增效作用

補腎健脾、扶正祛邪中藥在荷瘤小鼠化療過程中的減毒增效作用

張江華李恩李彬

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北石家莊050017)

摘要〔〕目的通過體內(nèi)實驗研究扶正祛邪中藥的抗腫瘤作用及對外周血細胞凋亡的影響。方法采用昆明小鼠肉瘤移植模型，隨機分為5組：正常對照組，腫瘤模型組，中藥治療組，環(huán)磷酰胺治療組，中藥+環(huán)磷酰胺治療組，觀察抑瘤效應(yīng)并檢測腫瘤生長抑制率、平均存活期、血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、外周血象及對荷瘤小鼠外周血細胞凋亡。結(jié)果各實驗組對荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用，環(huán)磷酰胺(CTX)+中藥治療組抑瘤率達到81.4%；中藥治療或CTX+中藥治療后腫瘤生長受到抑制，與腫瘤生長抑制率一致，減輕化療的骨髓抑制作用。結(jié)論CTX聯(lián)合中藥治療具有抗癌、減輕骨髓抑制作用，拮抗CTX的毒副作用，進一步延長荷瘤小鼠的壽命的作用。

關(guān)鍵詞〔〕中藥；化療；減毒增效

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：李恩(1929-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)和臨床研究。

第一作者：張江華(1976-)，女，副教授，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

細胞凋亡是化療后惡性腫瘤細胞死亡的主要方式之一。既往一些實體瘤和腫瘤細胞株的凋亡研究工作都證實〔1～3〕，癌細胞在化療藥物作用下都出現(xiàn)細胞凋亡明顯增高的現(xiàn)象。但是化療藥物對外周血細胞凋亡情況，未引起足夠的重視。中醫(yī)對于惡性腫瘤治療的研究多集中于提高機體免疫力，增強患者對放、化療的敏感性，抑制癌細胞增殖和促進癌細胞凋亡等方面〔4，5〕。目前一致認為腫瘤病人各病期多有氣血陰陽虛損之癥，采用和虛則補之，扶正固本，中西醫(yī)藥并用，既攻又補，以達到治療腫瘤又不損傷機體元氣的目的。本文觀察“補腎健脾，祛痰散結(jié)”中藥的抗癌作用及對化療毒性的拮抗作用。

1材料與方法

1.1藥物補腎健脾、扶正祛邪中藥由枸杞子，茯苓，人參，生薏米仁，白術(shù)，當歸，清半夏，首烏等組成(水煎、過濾、濃縮按成人劑量的15倍制成含生藥1.05 g/ml)，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省中醫(yī)院中藥房提供。

1.2實驗細胞株肉瘤S180，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗動物研究室提供。

1.3主要試劑、藥品及儀器四甲基偶氮唑藍(MTT)，二甲基甲酰胺均為美國Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品)；乳酸脫氫酶(LDH)檢驗試劑盒(南京建成生物工程研究所)；環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號0608155)。CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠制造)。

1.4建立小鼠肉瘤移植模型及給藥取昆明鼠18～22 g 90只(合格證書：冀醫(yī)動之第036號)，SPF級，雌雄各半，隨機分為5組：正常對照組，模型組，中藥治療組，環(huán)磷酰胺(CTX)治療組，中藥+環(huán)磷酰胺治療組，每組18只。模型組和各治療組右腋皮下接種S180細胞0.2 ml/只(細胞濃度為5×106/ml)，造成實體瘤模型。所有小鼠均從接種腫瘤細胞之日起同時給藥，中藥0.4 ml·kg-1·d-1灌胃，CTX腹腔注射30 mg·kg-1·d-1(劑量按體重計算相當于成人的10～15倍)，連續(xù)給藥10 d，對照組給予水。

1.5腫瘤生長抑制率于末次給藥后次日，每組隨機處死動物8只剝離瘤稱重，并觀察剩余動物死亡時間，按公式計算腫瘤抑制率和存活延長率。

1.6藥物對荷瘤小鼠血清乳酸脫氫酶LDH活性的影響分離血清，按LDH試劑盒說明測定血清LDH的活性。

1.7藥物對荷瘤小鼠外周血白細胞的影響取外周血1 ml，分離單個核細胞，PBS洗滌，70%乙醇固定，PBS洗滌，RNA酶消化PI染色，F(xiàn)ACS分析細胞凋亡率、S期細胞比率(SPF)及增殖指數(shù)(PI)。

1.8藥物對荷瘤小鼠紅細胞、血紅蛋白及血清促紅細胞生成素(EPO)的影響取抗凝血采用常規(guī)計數(shù)法計數(shù)紅細胞;高鐵氰化鉀法測血紅蛋白含量；胎肝細胞法測EPO活力。

1.9藥物對腫瘤組織凋亡的影響取各組S180實體瘤，PBS洗滌,剪成1 mm3大小，70%乙醇固定，蛋白酶K消化，PI染色，F(xiàn)ACS流式細胞儀分析細胞凋亡及細胞周期。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行ANOVA單因素方差分析方法，使用LSD方法進行多重比較。

2結(jié)果

2.1腫瘤生長抑制率各實驗組對荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用，CTX治療組、中藥治療組及CTX+中藥治療組對腫瘤生長的抑制率與模型組相比差異顯著(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1　扶正祛邪復(fù)方對S180的抑瘤作用

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

2.2荷瘤動物平均存活期CTX治療組，中藥治療組，CTX+中藥治療組動物的存活時間分別為：(12.6±2.2)d，(11.8±4.2)d，(14.2±1.3)d與模型組(8.3±0.8)d相比差異顯著(P<0.01或P<0.05)。

2.3血清LDH活性測定模型組血清LDH活性為(92.35±32.14)U/ml，與正常對照組(63.74±26.53)U/ml比較差異顯著(P<0.05)，中藥治療組為(81.42±18.43)U/ml，與模型組比較有所下降但無顯著差異(P>0.05)。CTX治療組為(59.37±27.66)U/ml，CTX+中藥治療組為(52.29±34.23)U/ml，與模型組差異顯著(P<0.05)，表明化療，中藥治療或CTX+中藥治療后腫瘤生長受到抑制，與腫瘤生長抑制率一致。

2.4藥物對荷瘤小鼠外周血白細胞凋亡的影響荷瘤小鼠外周血白細胞的凋亡率，SPF和PI均明顯高于正常對照組(P<0.01或<0.05)；CTX治療組凋亡率進一步升高與模型組比較差異顯著(P<0.05)，SPF和PI均有所降低，PI降低尤為明顯(P<0.01)；中藥治療組外周血細胞凋亡率明顯下降(P<0.01)，SPF和PI均有所升高但無顯著意義(P>0.05)，PI值明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2　藥物對S180荷瘤小鼠外周

與正常對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；與CTX治療組比較：5)P<0.05

2.5藥物對荷瘤小鼠紅細胞，血紅蛋白及血清EPO的影響①正常對照組小鼠紅細胞計數(shù)為(9.3±1.0)×107個/ml；模型對照組為(9.0±0.8)×107個/ml，中藥治療組為(9.6±0.5)×107個/ml，CTX化療組下降到(7.3±0.6)×107個/ml(與模型組比較P<0.01)，CTX+中藥治療組為(9.4±1.3)×107個/ml(與CTX治療組比較P<0.01)。②正常對照組小鼠血紅蛋白含量為(12.0±1.6)g/100 ml，模型組為(11.5±1.2)g/100 ml，中藥治療組為(11.1±0.9)g/100 ml，CTX治療組為(8.2±0.9)g/100 ml(與模型組比較P<0.01)，CTX+中藥治療組為(12.8±2.8)g/100 ml(與CTX治療組比較P<0.01)。③正常對照組小鼠EPO的活性為(18.1±8.0)mU/ml,模型組為(18.7±8.6)mU/ml，中藥治療組為(26.4±8.6)mU/ml，與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，CTX治療組為(44.4±8.3)mU/ml，與模型組比較差異顯著(P<0.05)，CTX+中藥治療組為(28.7±9.2)mU/ml，與CTX治療組比較差異顯著(P<0.05)。

3討論

就環(huán)磷酰胺來講，雖然對多種惡性淋巴瘤、白血病等有較好的療效，但同時其毒性作用也相當嚴重：免疫抑制，骨髓抑制，各種血細胞減少，肝腎毒性，惡心，嘔吐，脫發(fā)等〔6，7〕。本實驗證實，CTX在誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞凋亡的同時，也導(dǎo)致外周血白細胞凋亡，紅細胞減少，血紅蛋白降低的貧血癥狀。從中醫(yī)角度，化療副反應(yīng)主要表現(xiàn)為損傷氣血，脾胃失調(diào)及肝腎虧損等證候。

中醫(yī)認為，癌癥屬中醫(yī)外科的“陰毒惡論”，“石瘤”，“積聚”和“貯痰”等。不管“里寒陰毒證”。特別是中晚期患者，其病灶中所加的物質(zhì)有屬中醫(yī)的“里寒濕證”。從臨床表現(xiàn)來看，患者大多為痰濕蘊結(jié)，陽氣不足或“陽虛寒濕”的共同病機，從損害的程度來看，大多表現(xiàn)為脾、腎、肺、肝、胃等的氧氣虧虛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對中醫(yī)藥在腫瘤治療中的作用已進行了廣泛的研究，鑒于數(shù)代人的認識，綜合擬定以“補腎健脾，祛痰散結(jié)”為主的治療大法，通過溫補人體陽氣和甘酸寒味之品的配伍，調(diào)理臟腑，經(jīng)絡(luò)，氣血，陰陽，又兼攻堅消積，抗腫瘤，研究扶正祛邪復(fù)方對實驗?zāi)[瘤的治療作用及減輕化療毒副反應(yīng)的作用，具有互補，達到減毒增效的目的。

本實驗結(jié)果顯示正常小鼠外周血細胞凋亡和增殖趨于平衡,荷瘤小鼠外周血細胞凋亡明顯較正常小鼠多，細胞增殖活性變化不大，化療后細胞凋亡進一步增多，細胞增殖活性卻顯著降低，合并中藥治療可防止化療對荷瘤小鼠外周血細胞的這種作用，單純中藥又降低荷瘤小鼠外周血細胞凋亡率和提高細胞增殖活性的趨勢。據(jù)現(xiàn)有資料分析〔8〕，惡性腫瘤患者外周血細胞凋亡增加的原因有：①外周血免疫細胞通過凋亡機制的清除，腫瘤細胞侵入外周血中，成為新的抗原，刺激機體免疫系統(tǒng)，使免疫細胞數(shù)量增加，功能增強，免疫系統(tǒng)在執(zhí)行功能過程中有大量免疫細胞凋亡，沒有免疫細胞凋亡，機體就不會有健全的免疫防御系統(tǒng)。②化療藥物作用腫瘤患者機體后，不僅誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，同時也誘導(dǎo)正常體細胞和淋巴細胞凋亡。本實驗結(jié)果與此一致。

本實驗表明，該復(fù)方能阻止CTX對白細胞，紅細胞，血紅蛋白的降低作用。腎性貧血是血清EPO水平升高較少，腎衰時EPO產(chǎn)生不足。CTX可因骨髓抑制引起小鼠外周血紅細胞及HB降低，導(dǎo)致血清EPO水平代償性升高。本實驗中扶正祛邪復(fù)方可改善骨髓造血抑制CTX引起的血清EPO水平代償性升高，表明中藥的整體調(diào)節(jié)作用。

該復(fù)方單獨應(yīng)用及與CTX聯(lián)合應(yīng)用治療S180實驗?zāi)[瘤小鼠表明：該復(fù)方能抑制腫瘤生長延長荷瘤小鼠壽命，與CTX聯(lián)合應(yīng)用時可拮抗CTX的毒副作用，進一步延長荷瘤小鼠的壽命，從不同側(cè)面為該方藥的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4參考文獻

1Xu RC，Chen XY，Chen L.The initial research on hoptoad inducing human HL-60 cell apoptosis〔J〕.Chin J Chin Med，2001；26(1)：59-61.

2Rong Y，Liang FY，Chen L.The dehydromethyl organies of tiger beetle inducing the lineages of mammary cancer apoptosis and influencing the expression of bcl-2〔J〕.Cancer，2000；19(12)： 1077-81.

3Liu CX，Gao G，Sun M,etal.Study on compound-polysaccharide of fungi inducing liver cancer Bel-7402 cell apoptosis〔J〕.J Hyg Res，2001； 30(1)：40-3.

4袁宗軍.中西醫(yī)結(jié)合治療惡性腫瘤探討〔J〕.中醫(yī)藥研究，2002；18(3)：61.

5郁仁存.中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治研究的進展〔J〕.中國腫瘤，1999；8(10)：461.

6譚先杰，吳嗚，郎景和.婦科惡性腫瘤化療后骨髓抑制處理中的實用問題〔J〕.實用婦產(chǎn)科雜志，2009；25(5):272.

7陳志偉，祝彼得，嚴蘇純，等.骨髓抑制性貧血小鼠模型的研究〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006；16(5):260-2.

8周振英，張軍妮，朱月清.香菇多糖對腫瘤患者外周血細胞凋亡的影響〔J〕.中國腫瘤生物治療學(xué)雜志，1997；4(3)：233.

〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)