靈芝孢子粉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

靈芝孢子粉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

姚金福趙婉軍楊波樊湘澤范曉清

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130117)

摘要〔〕目的探討靈芝孢子粉對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法對(duì)16HBE細(xì)胞體外培養(yǎng)，分別給予不同劑量靈芝孢子粉預(yù)保護(hù)24 h后，給予LPS(1 μg/ml)刺激6 h，采用MTT法檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞活性，檢測(cè)細(xì)胞上清液中的超氧化歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)等。采用Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核因子(NF)-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果靈芝孢子粉可明顯提高人氣道上皮細(xì)胞的活力，顯著降低細(xì)胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6；顯著提高SOD的含量；并顯著降低細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)論靈芝孢子粉對(duì)LPS誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕靈芝孢子粉；人氣道上皮細(xì)胞；脂多糖

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：吉林省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(2012-074)

第一作者：姚金福(1960-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)研究。

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道上皮細(xì)胞可以合成和釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，這些因子是哮喘發(fā)病的主要原因，氣道炎癥可以引起上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，并造成炎癥反應(yīng)的加重，從而造成上皮細(xì)胞的凋亡脫落；同時(shí)，還會(huì)造成氣道內(nèi)細(xì)胞及組織的改變和氣道重塑〔1～4〕。靈芝孢子粉為擔(dān)子菌綱多孔科靈芝屬真菌靈芝生長(zhǎng)成熟后散發(fā)出來(lái)的孢子體，富含多糖、肽、有機(jī)鍺、多種氨基酸、脂肪酸及微量元素等成分。孢子粉可改善機(jī)體的免疫功能， 減輕放、化療的不良反應(yīng)。藥理研究表明，靈芝孢子粉可明顯增強(qiáng)人體免疫功能，并對(duì)多種腫瘤有明顯的抑制作用〔5～7〕。本研究通過(guò)研究靈芝孢子粉對(duì)脂多糖(LPS) 致人氣道上皮細(xì)胞損傷的影響，評(píng)價(jià)靈芝孢子粉保護(hù)人氣道上皮細(xì)胞的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物靈芝孢子粉由吉林省長(zhǎng)白工坊科貿(mào)有限公司提供，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王德友教授鑒定為正品。

1.2試劑人氣道上皮細(xì)胞株16HBE(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)；丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，白介素(IL)-6、 腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κBP65抗體等試劑盒購(gòu)自上海研域生物科技有限公司；改良細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)(高糖)和胎牛血清(上?？泼羯锟萍加邢薰?；LPS(L2880，大腸桿菌055)、B5HNE和四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國(guó)Sigma公司)。

1.3儀器超凈工作臺(tái)：蘇州安泰BSC-1600型生物潔凈安全柜。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：美國(guó)Invitrogen公司。CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Nuaire公司。電泳儀：美國(guó)伯樂公司。酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂公司。

1.4方法

1.4.1人氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)及分組16HBE細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，以1×105/ml接種于24孔板中并置于37℃，飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)70%時(shí)更換成無(wú)血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分組：①空白對(duì)照組，無(wú)血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)；②LPS組(LPS 1 μg/ml)；③低靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉0.5 g/L)；④中靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉1 g/L;⑤高靈芝孢子粉組(靈芝孢子粉2 g/L)。除空白對(duì)照組，其余各組使LPS作用6 h后，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.2MTT檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞加入各濃度靈芝孢子粉培養(yǎng)24 h后，加入1 μg/ml的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，492 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.4.3檢測(cè)SOD，MDA，TNF-α，IL-6收集各種細(xì)胞上清液，按照檢測(cè)試劑說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κBP65收集各組細(xì)胞并加入預(yù)冷的RIPA裂解液和相應(yīng)的蛋白酶抑制劑，4℃，15 000 r/min離心15 min后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg上清液經(jīng)8% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h后，一抗4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。顯色后，以相應(yīng)的總蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1靈芝孢子粉對(duì)人氣道上皮細(xì)胞活力的影響與空白對(duì)照組〔(92.11±3.01)%〕相比，LPS組顯著降低16HBE細(xì)胞活力〔(52.07±2.15)%〕；而低、中、高濃度各組靈芝孢子粉均能顯著提高細(xì)胞活力〔(69.82±2.11)%、(75.12±2.39)%、(79.28±2.52)%〕。見表1。

2.2靈芝孢子粉對(duì)人氣道上皮細(xì)胞上清液MDA與SOD的影響與空白組相比,LPS組細(xì)胞上清液中MDA含量升高，SOD含量降低;各組靈芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，升高SOD含量。見表1。

2.3靈芝孢子粉對(duì)人氣道上皮細(xì)胞上清液TNF-α，IL-6的影響與空白組相比,LPS組細(xì)胞上清液中TNF-α，IL-6含量升高;各組靈芝孢子粉可降低上清液中MDA含量，提高SOD含量。見表2。

2.4靈芝孢子粉對(duì)人氣道上皮細(xì)胞NF-κBP65的影響與空白組(0.11±0.061)相比,LPS組細(xì)胞內(nèi)NF-κBP65含量升高(0.72±0.103);低、中、高劑量組靈芝孢子粉可降低NF-κBP65含量(0.58±0.089、0.39±0.072、0.31±0.121)。見圖1。

表1　靈芝孢子粉對(duì)SOD、MDA的影響

與LPS組比較：1)P<0.05，下表同

表2　靈芝孢子粉對(duì)TNF-α，IL-6的影響

A：空白組；B：LPS組；C：靈芝孢子粉0.5 g/L；D：靈芝孢子粉1 g/L；E：靈芝孢子粉2 g/L 圖1　各組16HBE細(xì)胞中NF-κBP65蛋白水平

3討論

近年來(lái)，對(duì)哮喘的研究多集中在炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞的增殖方面，而對(duì)氣道上皮的研究不多。而氣道上皮損傷與氣道炎癥的發(fā)生相關(guān)，也是導(dǎo)致氣道重塑、哮喘難于治療的重要因素〔8〕。TNF-α、IL-6等多種炎癥介質(zhì)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中都存在著NF-κB序列，NF-κBP65的活化促進(jìn)炎癥因子的生成〔9,10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝孢子粉可減低LPS損傷細(xì)胞上清液中的MDA、TNF-α、IL-6，提高SOD，并能減低細(xì)胞內(nèi)NF-κBP65含量。因此，認(rèn)為靈芝孢子粉有保護(hù)氣道上皮細(xì)胞損傷作用。

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〔2014-07-15修回〕

(編輯徐杰)

《中國(guó)免疫學(xué)雜志》征稿、征訂啟事

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