siRNA沉默Bmi－1表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

siRNA 沉默Bmi-1表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

劉丹丹鄭翔宇1，2劉奔劉純青1王藝芳1趙寶霞1孟秀香1

(大連醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧大連116044)

摘要〔〕目的觀察Bmi-1基因沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖和侵襲影響并初步探討其機(jī)制。方法根據(jù)四條針對(duì)Bmi-1的小干擾RNA(siRNA)序列，將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，選擇最有效的一條鏈并構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體pSUPERretro-Neo中，形成重組載體，然后將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bmi-1-shRNA的A549細(xì)胞。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bmi-1-siRNA對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響；Transwell小室觀察其對(duì)A549侵襲能力的影響；RT-PCR和明膠酶譜法分別觀察siRNA對(duì)A549細(xì)胞MMP-2/MMP-9表達(dá)及活性的影響。結(jié)果Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細(xì)胞MMP-2/MMP-9的表達(dá)和活性。結(jié)論Bmi-1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的抑制和MMP-2/MMP-9的活性降低有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕肺腺癌；siRNA；Bmi-1基因；侵襲

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R734〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)

通訊作者：孟秀香(1965-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。

1大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院2河南省中醫(yī)院檢驗(yàn)科

第一作者：劉丹丹(1964-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。

目前對(duì)肺腺癌發(fā)生發(fā)展確切機(jī)制的了解仍較為貧乏，因此研究肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床意義。Bmi-1最初作為原癌基因被Van Lohuizen等人〔1〕發(fā)現(xiàn)，Bmi-1與c-myc基因協(xié)同使得B淋巴細(xì)胞發(fā)生改變從而導(dǎo)致了鼠淋巴白血病〔2〕。近年研究表明，Bmi-1基因在人類(lèi)一些常見(jiàn)的惡性腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌等腫瘤中都存在高表達(dá)情況〔3～6〕，與腫瘤的增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有關(guān)Bmi-1在肺癌中的表達(dá)已有報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中Bmi-1表達(dá)較正常肺組織相比明顯增高〔7〕。并且Bmi-1在肺癌的晚期較肺癌早期表達(dá)明顯增高〔8〕，這說(shuō)明Bmi-1參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。以往研究中，針對(duì)Bmi-1基因設(shè)計(jì)4對(duì)發(fā)夾式Bmi-1 siRNA質(zhì)粒，均能抑制子宮頸癌Hela細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力〔9〕。本文研究沉默Bmi-1基因的表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為A549-wt，轉(zhuǎn)染PSUPER-retro-neo-Bmi-1和自由序列的分別命名為A549-siRNA-Bmi-1和A549-ctr。

1.2RT-PCR總RNA用Trizol試劑提取，然后按照TaKaRa的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。MMP-2基因上游引物：5′-TGGCAGTGCAATACCTGAAC-3′，MMP-2基因下游引物：5′-CCGTACTTGCCATCCTTCTC-3′；MMP-9基因上游引物：5′-AGTGGCACCACCACA ACA T-3′，MMP-9基因下游引物：5′-TCCTGGGTGTAGAGTCTCTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，GAPDH下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5%溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳中分離。

1.3四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三組細(xì)胞消化后按每孔細(xì)胞數(shù)為2×103單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，1 d后各組分別取5孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)5 d。檢測(cè)時(shí)每孔加入MTT 10 μl，4 h后小心吸去孔內(nèi)的液體，加入150 μl DMSO，震蕩15 min，使結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度。

1.4細(xì)胞侵襲試驗(yàn)按照BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。大致如下：將無(wú)血清培養(yǎng)基加入小室，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2 h。除去培養(yǎng)基，加入濃度為1×105/ml的細(xì)胞懸液0.5 ml(無(wú)血清)。下室加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基0.75 ml。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)48 h。用棉簽將殘留在上室內(nèi)表面的細(xì)胞拭去。用10%甲醛固定遷移至小室外表面的細(xì)胞，0.25%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，取5個(gè)視野(×400)細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。

1.5明膠酶譜分析取等量的三組細(xì)胞接種在6孔板上，待80%融合時(shí)換無(wú)血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h收集上清液。1 000 r/min離心5 min，分裝，-80℃保存。制膠結(jié)束后(分離膠含0.1%明膠的)，自冰箱中拿出細(xì)胞上清液，加入無(wú)β-巰基乙醇的5×上樣緩沖液后進(jìn)行上樣、電泳。取出PAGE膠，在含2.5%TritonX-100洗脫液震蕩洗滌15 min×4次，加入明膠酶緩沖液，37℃孵育48 h。再進(jìn)行脫色直至出現(xiàn)清晰條帶。凝膠成像，圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1Bmi-1 siRNA抑制A549細(xì)胞的體外增殖能力MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞每天的吸光度值，A549 Bmi-1 siRNA細(xì)胞在第三天及以后的時(shí)間OD值明顯低于A549-ctr 和A549-wt兩組細(xì)胞，生長(zhǎng)速度明顯受到抑制(P<0.05)；而后兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　沉默Bmi-1基因?qū)549細(xì)胞體外增值能力的

與A549-siRNA-Bmi-1比較：1)P<0.05

2.2Bmi-1 siRNA抑制A549細(xì)胞的侵襲能力Transwell方法檢測(cè)沉默Bmi-1基因后對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響，A549-Bmi-1-siRNA細(xì)胞組的侵襲能力顯著低于A549-wt和A549-ctr細(xì)胞組(P<0.01),而A549-wt和A549-ctr細(xì)胞組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　沉默Bmi-1基因?qū)549細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)

2.3沉默Bmi-1表達(dá)對(duì)MMP-2/MMP-9表達(dá)及活性的影響

2.3.1RT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)結(jié)果A549-Bmi-1-siRNA細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)比A549-wt和A549-ctr細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3.2明膠酶譜法檢測(cè)沉默Bmi-1基因后對(duì)MMP-2和MMP-9活性的影響如圖3所示，A549-Bmi-1 siRNA細(xì)胞組MMP-2

圖2　RFT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)

圖3　沉默Bmi-1基因?qū)549細(xì)胞MMP-2/MMP-9 活性的影響

(active形式)和MMP-9(active形式)顯著低于A549-wt和A549-ctr細(xì)胞組(P<0.05)，而A549-wt和A549-ctr細(xì)胞組酶譜分析結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3討論

本文結(jié)果表明沉默Bmi-1基因能夠減弱A549細(xì)胞的體外增殖能力侵襲是惡性腫瘤也是最重要的惡性生物學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜表面特定的受體與細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜中的層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的黏附在一起，然后通過(guò)釋放一些蛋白水解酶類(lèi)或激活基質(zhì)中已經(jīng)存在的酶原來(lái)促使基質(zhì)成分發(fā)生降解，癌細(xì)胞才得以遷移至被水解的基質(zhì)空隙中，通過(guò)這一方式癌細(xì)胞不斷向基質(zhì)深層侵襲，為下一步的轉(zhuǎn)移打下了基礎(chǔ)。鋪有人工基底膜Transwell小室是目前檢測(cè)癌細(xì)胞體外侵襲能力的簡(jiǎn)單而有效的方法。Transwell小室實(shí)驗(yàn)中采用的基質(zhì)膠Matrigel是從EHS小鼠腫瘤中提取的基質(zhì)成分，富含層黏連蛋白以及Ⅳ型膠原等成分。將基質(zhì)膠Matrigel鋪在侵襲小室的多孔濾膜上，能夠形成和天然基底膜非常類(lèi)似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以模擬體內(nèi)的基質(zhì)狀況。小室下方的血清濃度高于上方，所以，具有侵襲能力的細(xì)胞就會(huì)朝向高血清濃度方向趨動(dòng)，穿過(guò)人工基底膜和直徑為 8 pm的聚碳酸微孔濾膜。本研究發(fā)現(xiàn)干擾組A549細(xì)胞成功穿過(guò)Matrigel膜和小室濾膜的細(xì)胞數(shù)較兩個(gè)對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明轉(zhuǎn)染Bmi-1-shRNA能夠使肺腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

Liotta等〔10〕提出侵襲轉(zhuǎn)移三步學(xué)說(shuō)：即黏附、降解和移動(dòng)。其中血管基底膜的降解、破壞是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，基質(zhì)膜是機(jī)體阻礙癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要屏障。當(dāng)癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶遷移到細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，癌細(xì)胞能夠通過(guò)分泌多種蛋白水解酶來(lái)降解細(xì)胞外基質(zhì)，將基底膜這個(gè)阻礙癌細(xì)胞侵襲的屏障破壞。癌細(xì)胞從血管基底膜的破損處移出進(jìn)入到血管中，進(jìn)行血道轉(zhuǎn)移。從中不難看出，腫瘤細(xì)胞侵襲能力是其進(jìn)行轉(zhuǎn)移的必需前提，因而非常重要。而達(dá)到侵襲目的的前提是其能分泌一些蛋白酶來(lái)降解細(xì)胞外基質(zhì)。能降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶包括四種，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是所有蛋白酶中最重要的一種。在癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的這一復(fù)雜過(guò)程中，MMPs起著非常重要的作用，是一類(lèi)依賴(lài)鋅離子的細(xì)胞外蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，能促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔11，12〕。根據(jù)其作用底物的類(lèi)型不同，可將金屬蛋白酶分為五大類(lèi)，即膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解酶、巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶。這些酶的主要功能是降解各種類(lèi)型的膠原、明膠蛋白、纖連蛋白、層連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。在這些酶中，最為重要同時(shí)研究比較清楚的是明膠酶MMP-9和MMP-2〔13〕，二者可以催化水解細(xì)胞間基質(zhì)成分，降解基膜的主要成分膠原，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周?chē)＝M織浸潤(rùn)〔14〕。Suzuki等〔15〕發(fā)現(xiàn)在NSCLC中的MMP-2和MMP-9均有高表達(dá)，且MMP-2的表達(dá)明顯強(qiáng)于MMP-9，故認(rèn)為MMP-2在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮比MMP-9更加重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高侵襲肺腺癌細(xì)胞株A549中，MMP-2的表達(dá)及活性也確實(shí)高于MMP-9。Bmi-1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但它與MMPs是否有關(guān)及其介導(dǎo)通路尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，Bmi-1-shRNA抑制了A549細(xì)胞MMP-2/MMP-9 mRNA表達(dá)及MMP-2/MMP-9的活性，Bmi-1與肺腺癌的侵襲特性密切相關(guān)。

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〔2014-03-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)