聚丙烯酰胺凝膠電泳快速染脫色方法的應用

聚丙烯酰胺凝膠電泳快速染脫色方法的應用

李建偉李俐陸陪信李曉林張家穎

(吉林大學白求恩醫(yī)學院生物化學與分子生物學中心，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討建立聚丙烯酰胺凝膠電泳的無毒性染色和快速脫色的方法。方法在染色和脫色時分別10%的三氯醋酸代替高濃度的醋酸，用乙醇替代有毒性的甲醛，同時用微波加熱染色、脫色。結果與傳統(tǒng)方法比較，在不影響檢測靈敏度的情況下，減少了有毒性有機溶劑使用，大大縮短分析所需時間，且降低實驗成本。結論改良方法具有染色背景淺、省時、降低成本、安全低毒等優(yōu)點，是一種便于推廣的好方法。

關鍵詞〔〕電泳；聚丙烯酰胺；蛋白質(zhì)染色

中圖分類號〔〕R33〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助(No.30570688)

通訊作者：李俐(1957-)，女，高級實驗師，主要從事生化實驗技術改革研究。

第一作者：李建偉(1961-)，男，主管技師，主要從事生物化學實驗技術改革研究。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、分析蛋白質(zhì)常用的方法。在蛋白質(zhì)組學試驗中，蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后的染色是十分重要的環(huán)節(jié)。電泳后的常規(guī)染色方法已有很多，目前一般采用的染色、脫色方法是用甲醇-醋酸〔1〕。但在學生的實驗中，脫色液用量相當大，且脫色時間長〔2〕，不但試劑成本耗費比較高、實驗時間長，而且甲醇的毒性有害健康〔3〕。為此，本文用乙醇代替甲醛，用10%的三氯醋酸代替高濃度的醋酸配制染色、脫色液，并用微波爐加熱染色、脫色的方法〔4，5〕，建立了一種成本低、無毒性的快速染色、脫色方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器丙烯酰銨、N，N'-甲叉雙丙烯酰銨、過硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甘氨酸(Tricine)、鹽酸、氫氧化鈉、四甲基乙二胺(TEMED)、核黃素、甘氨酸、蔗糖、溴酚藍、三氯乙酸(TCA) 、考馬斯亮藍G250、95%乙醇(均為上海生工生物工程有限責任公司)。電泳采用MV-Ⅱ型雙垂直板微型電泳系統(tǒng)。

1.1.2染色液、脫色液的配制見表1。

1.2實驗方法

1.2.1制膠取小燒杯，根據(jù)預定膠濃度，吸取定量的凝膠應用液，依次加入分離膠應用液、水、TEMED，慢速攪拌，并在真空干燥器中抽氣 3 min。加入過硫酸銨輕輕攪拌后，立即將膠液沿玻壁注入傾斜一定角度的垂直板型凝膠玻璃板模具中，至距上沿 約3 cm處。然后用滴管沿玻璃板內(nèi)壁緩緩注入一 層蒸餾水隔離空氣，室溫垂直放置，使凝膠液聚合。 30～40 min后分離膠完全聚合，傾出分離膠上的覆蓋層液體，用濾紙條吸干殘留水分。注入濃縮膠(小心不要產(chǎn)生氣泡)，將膠液加到距玻璃頂端1 cm處插入樣品模具梳子，放在紫外燈下，使凝膠聚合。膠凝后，去掉硅膠條。將凝膠板安裝在微型電泳槽上。在內(nèi)外緩沖液槽中均加入電極緩沖液，小心拔出樣品槽模具，加樣。

表1　改進前后染色液、脫色液配制方法對比 〔3〕

1.2.2樣品制備 取4份樣品液，5份40%的蔗糖-0.1%溴酚藍-1 mmol/L。

1.2.3加樣和電泳在樣品槽內(nèi)用微量注射器依次加入20～30 nm樣品溶液，電泳的條件為濃縮膠中的電壓120 V，待樣品進入分離膠后，改為150 V，當溴酚藍指示劑距玻璃板底部1 cm時，停止電泳。

1.2.4固定和染色方法1：將電泳完的凝膠放入用考馬斯亮藍R-250、甲醇、冰醋酸配制的染色液中，然后放在搖床上搖動染色，15 min后取出凝膠，用蒸餾水沖洗3次，再加入100 ml的脫色液，在搖床上脫色，20 min后倒掉變藍脫色液，然后用蒸餾水沖洗3次，棄去變藍的蒸餾水，再倒入100 ml脫色液重復上面操作3次。方法2：將電泳完的凝膠放入盛有100 ml的用考馬斯亮藍R-250、10%三氯醋酸、乙醇配制的染色液的塑料盤中，蓋子扣嚴，在微波爐中用高火照射10 s染色，然后用蒸餾水反復沖洗3次。再將凝膠放入100 ml脫色液中，高火檔照射20 s，然后倒掉脫色液，用蒸餾水沖洗，棄去變藍的蒸餾水。再加入新鮮脫色液再照射20 s，重復3 次，凝膠體積會逐漸縮小，將其用蒸餾水反復沖洗，恢復到原來的體積。凝膠先出現(xiàn)紫色條帶，然后逐漸變成較清晰的藍色條帶。

2結果

2.1不同染色方法比較實驗表明用乙醇代替甲醇，實驗分辨率幾乎沒有區(qū)別。見圖1，圖2。

圖1　用方法1染色、脫色的效果

圖2　用方法2染色、脫色的效果

2.2不同脫色方法的比較用原來的方法，加入脫色液然后放在搖床上染色脫色需要1.5～2 h；改用微波爐加熱方法染色、脫色只需要20～30 min，并且脫色效果更清晰。見圖1，圖2。

3討論

蛋白質(zhì)染色及固定原理實際上就是使蛋白質(zhì)變性，從水相中析出到凝膠相中，使其不再發(fā)生自由擴散，使用的染色劑中有三氯乙酸、乙醇，其分子不僅與蛋白質(zhì)的帶正電荷的側鏈結合，而且通過氫鍵和肽鍵結合，其結果使蛋白質(zhì)分子失去水化水分子，同時在肽鍵表面包上一層疏水的基團，這樣蛋白質(zhì)的水溶性被破壞后就從水相中沉淀到凝膠相上。另外，蛋白質(zhì)變性后結合染料的能力也大大增強了。所以，只要有足夠的三氯乙酸和乙醇溶液，染料的染色、固定作用就會好。經(jīng)過大量實驗證明，用乙醇和10%的三氯醋酸代替有毒性的甲醛及高濃度的醋酸完全可以達到同樣的染色效果，且減少了污染、降低了試劑的成本。

微波加熱能夠促進試劑向凝膠內(nèi)滲透和擴散以及分子間相互作用。水浴或微波加熱處理的目的是將凝膠中的蛋白快速地固定，以免其擴散，并可以大大節(jié)省膠片固定和染色時間、省卻過多的漂洗步驟。通過微波加熱處理可以在20～30 min內(nèi)完成凝膠的染色和脫色過程，與使用搖床染色、脫色方法相比，極大縮短了染色、脫色時間。膠片經(jīng)微波染色20 s即可達到用搖床方法染色1 h的效果，且微波脫色可在短時間內(nèi)使膠片底色脫除更加徹底。

通過實際應用，筆者發(fā)現(xiàn)用改進的染色、脫色方法不僅減少了毒性藥品的使用，同時大大縮短了實驗時間，且降低了實驗成本，可以在實驗室推廣。

4參考文獻

1練玉銀，劉志剛，溫岸玲.鯉魚主要變應原的分離、鑒定與純化〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2006;22(8)：947-9.

2倪菊華，梁靜，賈竹青.生物化學與分子生物學實驗教程〔M〕.北京：北京大學醫(yī)學出版社，2008：26-39.

3Wang X，Wang D，Wang D，etal.Systematic comparison of technical details in CBB methods and development of a sensitive GAP stain for comparative proteomic analysis〔J〕.Electrophresis，2012;33(2)：296-306.

4Marchetti-Deschmann M，Kemptner J，Reichel C，etal.Comparing standard and microwave assisted staining protocols for SDS-PAGE of glycoproteins followed by subsequent PMF with MALDI MS〔J〕.Proteomics，2009;72(4)：628-39.

5劉吉民，張家穎.醫(yī)學生物化學與分子生物學實驗教程〔M〕.長春：吉林大學出版社，2002：17-39.

〔2014-09-11修回〕

(編輯袁左鳴)