氣相色譜－質譜法測定魚肉中丁香酚的殘留

余穎

(福建省水產研究所，福建廈門 361013)

0 引言

為了使水產品在運輸過程中保持鮮活，減少因應激性反應造成缺氧或皮膚損傷而導致的經濟損失，國內近年普遍使用魚用麻醉劑來提高水產品運輸過程中的?；盥剩~用麻醉劑是一類能不同程度抑制魚腦感覺中樞，使魚失去反射動作的物質［1］．常用的魚用麻醉劑中，丁香酚以其高效、低價、高安全性，近年來受到廣泛關注．丁香酚，化學名為2－甲氧－4丙烯基酚，是一種香料，可作為全麻劑，對魚有強烈的麻醉作用，被廣泛應用于親魚采卵及活魚運輸中［2］．日本允許使用丁香酚作為魚用麻醉劑，日本肯定列表規(guī)定了丁香酚的最高殘留限量為0．05 mg·kg－1［3］．而我國尚未有丁香酚最高殘留限量的規(guī)定．2010年11月，廈門首次查獲一起用丁香酚麻醉活魚以提高存活率的案件，引發(fā)消費者對魚用麻醉劑的恐慌［4］．Kildea等［5］研究發(fā)現(xiàn)，對魚類進行重復麻醉會降低魚體凈化自身體內殘留麻醉劑的能力．目前國內尚缺少對魚用麻醉劑有效的監(jiān)管制度及使用安全性的權威判定，若人體通過攝食魚類攝入過量的魚用麻醉劑而對健康造成影響，將引起公眾對魚用麻醉劑安全性的擔憂，則不利于水產經濟的健康發(fā)展．

目前，國內對丁香酚的檢測多應用于食品及藥品中，水產品中丁香酚殘留的檢測還未見報道．食品及藥品中丁香酚的檢測方法主要有以下幾類:①液相色譜類，主要有高效液相色譜法［6－8］、固相萃?。咝б合嗌V法［9］、反相高效液相色譜法［10］等;②氣相色譜法［11］;③氣相色譜 －質譜聯(lián)用法［12－13］;④液相色譜－質譜聯(lián)用法，如液－液萃?。合嗌V－串聯(lián)質譜法［14］;⑤其它方法，如高效毛細管電泳法［15］等．這幾類方法的檢出限為7．4×10－4～3．5 g·kg－1不等．由于水產品富含蛋白質、脂肪及色素，樣品基質復雜，且丁香酚在水產品中的殘留量相對于食品及藥品中丁香酚含量較低，食品藥品的前處理方法及檢出限水平不適用于水產品中丁香酚痕量殘留的檢測．采用氣相色譜－質譜聯(lián)用法測定丁香酚在魚肉中的殘留量，定性及定量準確且靈敏度高，能滿足水產品中魚用麻醉劑殘留量日常檢測的需要，為水產行業(yè)對魚用麻醉劑的監(jiān)管提供依據．

1 材料與方法

1．1 主要儀器和試劑

Trace DSQ氣相色譜－質譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司);MS3旋渦振蕩器(德國IKA公司);KQ－250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);LD4－8離心機(北京時代北利離心機有限公司);固相萃取裝置(美國Alltech公司);HGC－24氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)．

正己烷、乙酸乙酯為色譜純;無水硫酸鈉為分析純(650℃灼燒4 h，冷卻后貯于密閉容器中備用);硅膠柱(Phenomenex，Strata Si－1，1 000 mg/6 mL)．

丁香酚(CAS:97－53－0)、甲基丁香酚(CAS:93－15－2)標準品購于德國Dr．Ehrenstorfer．

1．2 樣品處理

1．2．1 樣品預處理

鱸魚(Lateolabrax japonicus)、鰻鱺(Anguilla japonica)及石斑魚(Epinephelussp)，取可食部分均質混勻，置于－18℃ 冰箱中備用．

1．2．2 提取

稱取2 g樣品(精確至0．01 g)置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL正己烷，5 g無水硫酸鈉，旋渦振蕩1 min，超聲提取5 min．然后在3 500 r·min－1離心10 min，將上清液轉移到另一50 mL塑料離心管中．分別再用10 mL和5 mL正己烷重復提取，合并上清液．

1．2．3 凈化

硅膠柱用3 mL正己烷活化，樣液過柱，2 mL正己烷洗滌，吹干．7 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液．將洗脫液于40℃氮吹至約1 mL，加入質量濃度為2 mg·L－1的甲基丁香酚內標200μL，用乙酸乙酯定容到2 mL，供氣相色譜－質譜分析．

1．3 分析條件

1．3．1 色譜條件

色譜柱:DB－5MS(30 m×0．25 mm×0．25μm);升溫程序:起始溫度80℃，保持0．5 min，以7℃·min－1升到122℃，保持15 min，再以7℃·min－1升到150℃，保持8．5 min，最后再以35℃·min－1升到240℃，保持4 min;進樣口溫度:270℃，進樣方式:不分流進樣，進樣體積為1μL;載氣:高純氦氣(純度≥99．999%)，流速 1．0 mL·min－1．

1．3．2 質譜條件

離子源:EI源;電子能量:70 eV;離子源溫度:270℃;傳輸線溫度:260℃;溶劑延遲:5 min;采集方式:選擇離子監(jiān)測(SIM)模式．丁香酚的監(jiān)測離子是:103、131、149、164，其中164為定量離子，各離子豐度比為22∶19∶37∶100;甲基丁香酚的監(jiān)測離子是:91、147、163、178，其中178為定量離子，各離子豐度比為24∶43∶37∶100．

2 結果與討論

2．1 丁香酚的氣相色譜－質譜分析

按1．3的分析條件對0．2 mg·L－1丁香酚標準品和0．2 mg·L－1甲基丁香酚內標進行分析，選擇離子色譜圖如圖1所示．程序升溫可使丁香酚和甲基丁香酚實現(xiàn)較好的分離，保持基線穩(wěn)定，目標峰峰形對稱且附近干擾峰少，定性準確度高．色譜柱采用DB－5MS石英毛細管柱，柱流失小，適合用于質譜分析．

圖1 丁香酚和甲基丁香酚標準溶液選擇離子色譜圖Fig．1 Chromatogram of eugenol and methyleugenol

2．2 樣品前處理方法的研究

2．2．1 固相萃取柱的選擇

水產品基質復雜，富含脂肪、蛋白質、色素等雜質，若不進行有效凈化，將干擾丁香酚的定性定量分析，且會污染色譜柱和離子源．已有報道的丁香酚提取液的凈化多采用固相萃?。?］及液－液萃取方式［14，16］．液－液萃取方式對水產品基質的凈化效果不夠理想，因此較常采用固相萃取方式．固相萃取的主要優(yōu)勢在于對復雜樣品基質的凈化效果較好，可減少質譜應用中的離子抑制或離子增強現(xiàn)象，并能對極低濃度的組分進行富集，適用于水產品中痕量殘留的檢測．

丁香酚屬于弱極性分子，由于采用正己烷作為提取劑，大量脂質及類脂物質同時被提取出來，必須進行有效的脫脂處理．實驗分別比較了相同規(guī)格的硅膠柱、中性氧化鋁柱(Phenomenex，Strata AL－N，1 000 mg/6 mL)、弗羅里硅土柱(Phenomenex，Strata FL－PR，1 000 mg/6 mL)和氨基柱(Phenomenex，Strata NH2，1000 mg/6 mL)的凈化效果，結果如表1．在四種固相萃取柱中，硅膠柱對丁香酚(添加濃度為50μg·kg－1)的回收率最高，且對于脂肪含量較高或較低的樣品均能較好地去除雜質，因此實驗采用硅膠柱為凈化柱能滿足分析要求．

表1 不同固相萃取柱的凈化效果比較Tab．1 Comparison of purification effect of different SPE columns

2．2．2 洗脫液用量的優(yōu)化

將2 g空白樣品按1．2．2法提取，提取液加入丁香酚標準溶液(添加濃度為50μg·kg－1)，過硅膠柱，用乙酸乙酯洗脫，收集每毫升洗脫液，洗脫曲線如圖2所示．在洗脫體積為7 mL時，丁香酚可完全洗脫，因此選用7 mL為最佳洗脫體積．

按優(yōu)化后的樣品前處理方法所得的鱸魚、鰻鱺和石斑魚的空白樣品及加標樣品選擇離子色譜圖見圖3～5(丁香酚和內標甲基丁香酚的添加濃度都為50μg·kg－1)．結果表明，前處理過程簡單，樣品凈化完全，目標峰附近無雜質峰干擾．采用固相萃取凈化可有效地消除基質效應，保護色譜柱和離子源，提高方法靈敏度，且提取效率高．另外，方法采用內標法定量，可進一步消除基質效應，彌補外標法定量的不足．

圖2 丁香酚洗脫曲線Fig．2 The eluting curve of eugenol

圖3 鱸魚空白樣品和加標樣品選擇離子色譜圖Fig．3 Chromatogram of weever blank sample and blank sample added with eugenol

圖4 鰻鱺空白樣品和加標樣品選擇離子色譜圖Fig．4 Chromatogram of eel blank sample and blank sample added with eugenol

圖5 石斑魚空白樣品和加標樣品選擇離子色譜圖Fig．5 Chromatogram of grouper blank sample and blank sample added with eugenol

2．3 方法有效性的評價

2．3．1 線性范圍、檢出限和最低定量限

將丁香酚標準品和甲基丁香酚內標用乙酸乙酯配制成丁香酚質量濃度為0．005、0．01、0．025、0．05、0．1、0．25、0．5 mg·L－1及含甲基丁香酚內標質量濃度為0．2 mg·L－1的系列標準溶液，進行氣相色譜 －質譜分析，內標法定量．以標準溶液與內標物的響應值之比為縱坐標，以標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算相關系數(shù)．得到線性回歸方程為y=5．044 4x－0．007 3，在0．005～0．5 mg·L－1范圍內線性關系良好，相關系數(shù)R為0．999 8．

方法檢出限是在給定概率P=95%，顯著水平為5%時，能夠定性檢出的最小濃度，常以信噪比≥3表示．實驗中丁香酚在鱸魚、鰻鱺和石斑魚空白樣品中加標濃度為5μg·kg－1時，平均回收率為76．5% ～125%，相對標準偏差為4．65% ～9．53%，信噪比在7～20之間，因此確定丁香酚的檢出限為5μg·kg－1．

最低定量限是以空白測量值標準偏差的10倍相對應的濃度值，即10倍信噪比表示．實驗中丁香酚在鱸魚、鰻鱺和石斑魚空白樣品中加標濃度為10μg·kg－1時，平均回收率為82．4～95．3%，相對標準偏差為4．07% ～8．55%，且信噪比在25～36之間，因此，本方法確定丁香酚的最低定量限為10μg·kg－1．

2．3．2 方法的準確度和精密度

按1．2所述方法，分別在鱸魚、鰻鱺和石斑魚空白樣品中添加不同濃度的丁香酚進行加標回收試驗，添加濃度分別為10、50、200μg·kg－1，每個濃度水平重復6次．為了驗證方法的再現(xiàn)性，又進行了這三個濃度水平的日間加標回收試驗．結果如表2所示，日內平均回收率為82．6% ～93．2%，相對標準偏差為3．47% ～7．38%;日間平均回收率為80．6% ～89．3%，相對標準偏差為3．98% ～8．47%，均符合藥殘檢測技術要求．

表2 加標樣日內和日間平均回收率和相對標準偏差，n=6)Tab．2 Intra－day and inter－day average recoveries and RSDs of the spiked samples，n=6)

表2 加標樣日內和日間平均回收率和相對標準偏差，n=6)Tab．2 Intra－day and inter－day average recoveries and RSDs of the spiked samples，n=6)

添加濃度/μg·kg－1 樣品名稱 日內 日間x/% RSD/%x/% RSD/%91．5 6．25 89．3 8．47鰻鱺 93．2 7．38 86．7 6．88石斑魚鱸魚10 88．5 5．50 80．6 5．63 86．3 5．46 84．8 6．18鰻鱺 87．6 6．38 84．9 7．44石斑魚鱸魚50 86．0 7．21 81．3 6．75 82．6 4．12 84．6 3．98鰻鱺 83．7 3．47 86．4 4．15石斑魚鱸魚200 87．3 6．98 85．6 5．78

3 結語

研究建立了一種魚肉中丁香酚殘留的氣相色譜－質譜檢測方法，樣品預處理采用正己烷提取，硅膠柱凈化，乙酸乙酯洗脫的方法，過程簡單，縮短了樣品檢測周期，試劑用量少且毒性小、凈化效果好，適合樣品的批量檢測．方法的靈敏度和穩(wěn)定性較好，準確度和精密度均符合藥殘檢測技術要求，可應用于養(yǎng)殖魚類中丁香酚殘留的日常檢測．