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    白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的影響

    2015-12-29 10:42:53唐雪嬋馬偉平趙東強(qiáng)姜慧卿
    關(guān)鍵詞:凋亡白藜蘆醇黃疸

    王 娜,唐雪嬋,馬偉平,郭 昱,趙東強(qiáng),姜慧卿

    (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科,河北省消化病研究所,河北省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000)

    ·論著·

    白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的影響

    王娜,唐雪嬋,馬偉平,郭昱,趙東強(qiáng),姜慧卿*

    (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科,河北省消化病研究所,河北省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000)

    [摘要]目的探討白藜蘆醇(resveratrol,Res)對試驗(yàn)性梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的影響。方法健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、溶劑組、Res 10 mg組和Res 20 mg組各12只。模型組、溶劑組、Res 10 mg組和Res 20 mg組均結(jié)扎膽總管建立梗阻性黃疸大鼠模型,假手術(shù)組不結(jié)扎膽總管。采用鱟試劑終點(diǎn)顯色法檢測血漿內(nèi)毒素含量,HE和透射電鏡觀察小腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變,應(yīng)用比色法檢測腸組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,TUNEL法檢測腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。結(jié)果實(shí)驗(yàn)處理2 周后,模型組血漿內(nèi)毒素濃度較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。HE染色觀察模型組大鼠腺體排列紊亂,絨毛變鈍、短縮,伴有較多淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤。透射電鏡示腸黏膜微絨毛明顯稀疏,排列紊亂,細(xì)胞連接模糊、間隙增寬。腸黏膜組織MDA含量明顯高于假手術(shù)組,SOD活性明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。TUNEL法檢測示模型組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)較假手術(shù)組明顯升高。不同濃度Res干預(yù)后上述病理改變得到糾正,大鼠腸黏膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較模型組和溶劑組明顯降低(P<0.05),且SOD增加(P<0.05);大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05),Res 20 mg組較Res 10 mg組凋亡指數(shù)進(jìn)一步降低 (P<0.05)。結(jié)論OJ大鼠存在腸黏膜氧化應(yīng)激損傷,Res明顯改善OJ大鼠高腸源性內(nèi)毒素血癥,提高腸黏膜的抗氧化作用,抑制腸上皮細(xì)胞凋亡,具有保護(hù)腸黏膜屏障作用。

    [關(guān)鍵詞]黃疸,阻塞性;腸黏膜;氧化應(yīng)激;白藜蘆醇;凋亡

    doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.06.001

    梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)患者并發(fā)癥發(fā)生率和病死率居高不下,其主要原因是腎衰竭和敗血癥[1]?;A(chǔ)與臨床研究證實(shí)OJ存在腸黏膜屏障功能受損,主要病理生理機(jī)制是腸源性內(nèi)毒素血癥和腸黏膜通透性增加[2-3],具體機(jī)制尚未明確,而腸黏膜氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是導(dǎo)致OJ腸黏膜屏障功能障礙的關(guān)鍵因素[4]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種重要的植物抗毒素和抗氧化劑,可清除氧自由基,對于因氧化損傷引起的多種紊亂和失調(diào)疾患均有保護(hù)作用[5]。本研究建立OJ動物模型,探討Res對OJ大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的影響及保護(hù)機(jī)制,旨在為OJ腸黏膜屏障功能障礙的治療提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1動物分組選取清潔級健康雄性Wistar大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證編號903194),準(zhǔn)確稱質(zhì)量,標(biāo)記,隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、溶劑組、Res 10 mg組和Res 20 mg組各12只。

    1.2動物模型的制備和取材大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h開始禁食,自由飲水。3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取仰臥位,將動物四肢及頭固定于操作臺上,備皮、消毒、鋪無菌洞巾,于上腹正中作3 cm切口進(jìn)入腹腔,顯露第一肝門,鈍性游離并用3-0號絲線雙重結(jié)扎膽總管,然后在兩結(jié)扎線間橫斷,分2層縫合腹壁。假手術(shù)組僅進(jìn)行腹腔游離,不結(jié)扎膽總管。整個(gè)操作均在無菌條件下進(jìn)行,然后飼以正常飲水及復(fù)合飼料。自造模當(dāng)天始用Res灌胃,1%羧甲基纖維素鈉為溶劑。造模后2 周取材。門靜脈取血測定內(nèi)毒素,切取距回盲瓣約10 cm的小腸數(shù)段用生理鹽水漂洗后中性甲醛固定用于小腸組織病理學(xué)檢查和原位缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)染色,切取大小約1 mm×1 mm×1 mm組織以4%戊二醛固定,制備電鏡標(biāo)本,并留取少量腸組織-70 ℃低溫冰箱保存用于丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定。

    1.3主要試劑Res購自美國ALEXIS公司, TUNEL試劑盒購自美國金豐泰公司,終點(diǎn)顯色法鱟試劑盒購自上海坤肯生物生物化工有限公司,MDA、SOD試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司,DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.4血清內(nèi)毒素檢測器材無熱原處理,標(biāo)本置恒溫融化后,取血清0.1 mL,加Tris-Hcl 0.2 mL,無熱原0.9%氯化鈉溶液0.2 mL混勻,置100 ℃水浴10 min,離心,取上清0.1 mL測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出相應(yīng)內(nèi)毒素含量。

    1.5腸黏膜形態(tài)學(xué)檢測甲醛固定組織,石蠟包埋,連續(xù)切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察腸黏膜形態(tài)變化。

    1.6腸黏膜超微結(jié)構(gòu)檢測1%鋨酸固定組織,丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂618包埋,超薄切片,鈾染,鉛染,透射電鏡觀察。

    1.7腸黏膜組織MDA、SOD含量的檢測準(zhǔn)確稱取腸組織塊0.5 g,加4.5 mL生理鹽水制成10%組織勻漿。取100 μL標(biāo)本,按試劑盒說明采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量;黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量。

    1.8腸黏膜組織TUNEL染色參照TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。腸黏膜組織石蠟包埋切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水,蛋白酶K消化后,依次加入TUNEL反應(yīng)混合液、Converter-POD。DAB顯色,蘇木精,復(fù)染,中性樹脂封片。以不加TdT酶者作為陰性對照,細(xì)胞核呈棕色著色為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)計(jì)算方法:計(jì)數(shù)每100個(gè)腸黏膜上皮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù),每張切片任選3個(gè)視野,取其平均值。

    2結(jié)果

    2.1腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察光鏡觀察,假手術(shù)組大鼠腸黏膜上皮完整,絨毛腺體及排列整齊;模型組腺體排列紊亂,絨毛變鈍、短縮,黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞減少,伴有較多的淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤,部分有淋巴濾泡形成。Res不同劑量治療組腸黏膜病變較模型組明顯減輕,腸黏膜腺體及絨毛排列整齊,炎性細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

    2.2腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)觀察透射電鏡觀察,假手術(shù)組大鼠腸黏膜微絨毛排列整齊,細(xì)胞連接緊密完整。模型組腸黏膜微絨毛明顯稀疏,排列紊亂,連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞連接模糊、間隙增寬; Res不同劑量治療組腸黏膜上皮微絨毛排列整齊,細(xì)胞連接緊密。見圖2。

    2.3各組大鼠血漿內(nèi)毒素、MDA 、SOD含量和凋亡指數(shù)比較模型組血漿內(nèi)毒素濃度較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05);Res 10 mg組和Res 20 mg組內(nèi)毒素濃度明顯低于模型組和溶劑組,Res 20mg組較Res 10 mg組降低更多,但仍高于假手術(shù)組(均P<0.05)。模型組腸黏膜組織中MDA含量明顯高于假手術(shù)組 (P<0.05),Res 10mg組和Res 20 mg組MDA含量明顯低于模型組和溶劑組,Res 20 mg組較Res 10 mg組降低更多,但仍高于假手術(shù)組(均P<0.05)。模型組SOD明顯低于假手術(shù)組(P<0.05),Res 10 mg組和Res 20 mg組SOD明顯高于模型組和溶劑組(P<0.05),Res 20 mg組與Res 10 mg組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與假手術(shù)組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組凋亡指數(shù)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05),Res 10mg組和Res 20 mg組凋亡指數(shù)明顯低于模型組和溶劑組(P<0.05),Res 20mg組較Res 10 mg組降低更多(P<0.05),與假手術(shù)組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1,圖3。

    表1 各組大鼠血漿內(nèi)毒素、MDA 、SOD含量和凋亡指數(shù)比較Table 1 Plasma endotoxin,MDA,SOD concentrations and apoptotic index in different groups

    *P<0.05與假手術(shù)組比較#P<0.05與模型組比較△P<0.05與溶劑組比較☆P<0.05與Res 10mg組比較(SNK-q檢驗(yàn))

    3討論

    OJ是臨床常見病,其存在不同程度的腸黏膜屏障損傷[6-7],由于腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位繼而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥及多器官功能損傷,這也是OJ并發(fā)癥發(fā)生率和病死率居高不下的重要原因[8],但是具體分子機(jī)制尚不清楚。OJ誘發(fā)腸黏膜氧化應(yīng)激損傷是促成腸道屏障功能障礙和膿毒血癥發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。腸黏膜屏障受損伴隨大量炎性因子釋放,誘生型一氧化氮合酶表達(dá)增強(qiáng),使腸黏膜組織及細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧蓄積而導(dǎo)致氧化損傷,表現(xiàn)為腸黏膜蛋白氧化、脂質(zhì)過氧化增強(qiáng),蛋白質(zhì)、非蛋白巰基化合物或二硫化物比例失調(diào)[9-10]。氧化應(yīng)激可促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腸黏膜萎縮。腸黏膜細(xì)胞凋亡增加參與了病理狀況下腸黏膜的病變過程,不利于腸黏膜上皮再生與修復(fù),從而引起功能障礙[11-12]。

    MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,測試其含量可間接反映氧自由基對細(xì)胞的損傷程度;SOD能清除氧自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,是機(jī)體清除氧自由基的重要酶,超氧陰離子在SOD的作用下還原成過氧化氫,經(jīng)過氧化氫酶的作用變成羥自由基,最終被還原成水。其活力的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力,故MDA水平和SOD活力的測定可以反映機(jī)體的氧化和抗氧化平衡的狀態(tài)[13-14]。本研究通過建立膽道梗阻的動物模型,進(jìn)一步證明OJ大鼠存在高內(nèi)毒素血癥并伴有腸黏膜組織形態(tài)學(xué)損傷。光鏡觀察模型組大鼠腺體排列紊亂,絨毛變鈍、短縮,伴有較多的淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤;透射電鏡觀察模型組大鼠腸黏膜微絨毛明顯稀疏,排列紊亂,細(xì)胞連接模糊、間隙增寬;同時(shí)發(fā)現(xiàn)腸黏膜存在氧化應(yīng)激損傷,MDA水平升高,SOD水平下降,腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高。說明在OJ時(shí)腸道存在脂質(zhì)過氧化損傷及抗氧化能力下降,腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加,由此引起組織結(jié)構(gòu)破壞削弱了腸道屏障功能,這也為細(xì)菌穿透及進(jìn)一步腸源性內(nèi)毒素血癥發(fā)生提供可能。

    Res屬于黃酮類化合物,是從虎杖、葡萄皮等植物中提取的多酚化合物,是一種重要的植物抗毒素和抗氧化劑,具有清除氧自由基,可以抵御活性氧介質(zhì)對DNA的損傷并且防止細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。近年來,越來越多的研究表明Res對許多器官、組織、細(xì)胞都具有保護(hù)作用[15-17]。本研究結(jié)果顯示,Res治療組較模型組及溶劑組大鼠小腸黏膜MDA水平降低,SOD水平增加,模型組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡較假手術(shù)組明顯增加,Res治療組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組和溶劑組明顯降低,同時(shí)內(nèi)毒素血癥和腸黏膜組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損傷得到改善。說明Res通過影響巰基氧化還原狀態(tài)恢復(fù)腸黏膜的氧化應(yīng)激狀態(tài),阻止腸黏膜細(xì)胞的凋亡,從而增強(qiáng)腸黏膜屏障功能,防止發(fā)生內(nèi)毒素血癥,其具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

    綜上所述,腸黏膜氧化應(yīng)激損傷和腸上皮細(xì)胞凋亡參與了OJ時(shí)腸黏膜屏障障礙的發(fā)生,在臨床工作中OJ患者解除黃疸前后應(yīng)同時(shí)保護(hù)腸黏膜屏障功能,因?yàn)槟c黏膜屏障功能障礙以及伴隨的內(nèi)毒素血癥和氧化應(yīng)激損傷可能導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至危及生命的并發(fā)癥。Res明顯改善OJ大鼠高腸源性內(nèi)毒素血癥,提高腸黏膜抗氧化作用,抑制腸上皮細(xì)胞凋亡,具有保護(hù)腸黏膜屏障作用,為日后開發(fā)Res治療腸黏膜屏障功能障礙疾病提供了理論依據(jù)。(本文圖見封二)

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    (本文編輯:許卓文)

    [收稿日期]2015-03-09;[修回日期]2015-04-01

    [基金項(xiàng)目]河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2014206177)

    [作者簡介]王娜(1975-),女,河北辛集人,河北醫(yī)科大學(xué)第二 *通訊作者。E-mail:jianghq@aliyun.com

    [中圖分類號]R575

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    [文章編號]1007-3205(2015)06-0621-06

    Resveratrol on oxidative stress injury of intestinal epithelial cell in obstructive jaundice rats

    WANG Na,TANG Xue-chan,MA Wei-ping,GUO Yu,ZHAO Dong-qiang,JIANG Hui-qing*

    (Department of Gastroenterology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei Key

    Laboratory of Gastroenterology,Hebei Institute of Gastroenterology,Shijiazhuang 050000,China)

    [Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol(Res) on oxidative stress injury of intestinal epithelial cell in obstructive jaundice(OJ) rats.MethodsSham group was negative control group and solvent group as a positive control group, after two weeks′ experiment, the tissue samples were obtained.Healthy male Wistar rats were randomly divided into five groups:control group, model group,solvent group,Res 10 mg group and Res 20 mg group, each group contained 12 rats.OJ was successfully established in model group, solvent group,Res 10 mg group and Res 20 mg group after bile duct ligation.For control group,the choledochal duct was not ligated.Endpoint chromogenic assay with tachypleus amebocyte lysate was used to detect plasma endotoxin levels. HE stain method and transmission electron microscopy were used for morphological changes of intestinal mucosa.Colorimetric detection was made for intestinal tissue malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) activity. The apoptosis of mucosal cells was detected by TUNEL methods.ResultsTwo weeks after the experimental treatment,the plasma endotoxin concentration of model group was higher than that of sham operation group(P<0.05).The histological examination showed the glands of rats in model group arranged disorderly,villous blunting,shortening,accompanied by many lymphocytes and inflammatory cell infiltration.Transmission electron microscopy showed mucosal microvilli was disarranged and distorted,cell gap widened,fuzzy connection.Compared with sham operation group,the intestinal lipid peroxidation of model group increased; the MDA content in intestinal mucosa of model group was significantly higher than that of sham operation group,but SOD of model group markedly reduced(P<0.05).TUNEL analysis showed the intestinal epithelial cell apoptosis index of model group was significantly higher than that of sham operation group.The above pathological changes were corrected after being treated with Res in different concentrations,the content of MDA in intestinal mucosa significantly decreased compared with model group and solvent group(P<0.05),but SOD increased(P<0.05); The apoptotic index of mucosal cells in Res 20 mg treated group was significantly lower than that in Res 10 mg treated group(P<0.05).ConclusionThe intestinal epithelial cell in OJ rats results in high oxidative stress injury,Res can protect the intestinal mucosal barrier function in OJ rats through significantly ameliorating intestinal endotoxemia,improving the antioxidant function of intestinal mucosa,inhibiting the apoptosis of intestinal epithelial cells.

    [Key words]jaundice,obstructive;intestinal mucosa;oxidative stress;resveratrol;apoptosis

    醫(yī)院副主任醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,從事消化內(nèi)科疾病診治研究。

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