高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器法檢測(cè)茶葉中摻雜糖類物質(zhì)

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高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器法檢測(cè)茶葉中摻雜糖類物質(zhì)

陳 琦1*，李 立2，吳雪原1，儲(chǔ)曉剛2，許姍姍1，李德軍1，胡 堅(jiān)1

（1. 黃山出入境檢驗(yàn)檢疫局茶葉質(zhì)量安全研究中心，安徽 黃山 245000；

2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

〔摘 要〕使用超聲提取與分散基質(zhì)固相萃取對(duì)茶葉中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖進(jìn)行提取和凈化，使用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）法對(duì)茶葉4種糖進(jìn)行測(cè)定，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的線性范圍，半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的線性范圍，各組分響應(yīng)峰面積與其相應(yīng)濃度呈良好相關(guān)性，r>0.995。蔗糖、葡萄糖和果糖在2%，5%，20%添加水平下，半乳糖在1%，2.5%，10%的添加水平下，回收率為92 %～102 %，精密度為0.99%～2.26%。對(duì)黃山市休寧縣和黟縣兩個(gè)茶葉產(chǎn)區(qū)的茶葉進(jìn)行采樣分析，并對(duì)其中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖進(jìn)行測(cè)定以及分析統(tǒng)計(jì)。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)黃山地區(qū)夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本確定摻加了蔗糖；蔗糖含量在3%～7%之間的為可疑樣品。

〔關(guān)鍵詞〕茶葉；糖；摻雜；液相色譜；蒸發(fā)光檢測(cè)器

來(lái)自中國(guó)茶網(wǎng)的報(bào)道：“茶葉加糖和噴漿成為了潛規(guī)則， 加糖和噴漿主要是對(duì)夏秋茶加糖或噴漿達(dá)到美化外形和改善口感的目的，由于夏秋茶的茶葉嫩度差，外形松散，只有通過(guò)糖的粘性特性來(lái)達(dá)到收縮外形的目的，通過(guò)加糖也能大大提升茶葉的光澤度，更有甚者，通過(guò)添加大量的糖來(lái)增加茶葉的重量”（http://www.chinateaw.net/）。茶葉中糖類物質(zhì)摻雜使假已成為我們面臨的重大問(wèn)題。另外一方面，由于夏秋茶葉中多酚物質(zhì)含量高，氨基酸含量低，口感苦澀，適量的加糖能夠有效的改善口感，降低苦澀感。《GB/T 2760- 2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：食品添加劑使用時(shí)，不應(yīng)掩蓋食品本身或加工過(guò)程中的質(zhì)量缺陷或以摻雜、摻假、偽造為目的而使用[1]。

目前針對(duì)茶葉摻雜使假行為有一定的檢測(cè)手段：使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)茶葉中的灰分[2]、水浸出物進(jìn)行測(cè)定來(lái)初步判斷摻雜使假；使用熒光PRC鑒定茶葉中小麥摻雜[3]；使用原子吸收光譜法鑒定石灰、硫酸鎂等礦物質(zhì)的摻偽[4]；熱分析法檢測(cè)苦丁茶摻雜葡萄糖[5]。目前用于茶葉摻偽鑒定主要還是依靠感官審評(píng)進(jìn)行判斷。無(wú)論是用感官鑒定還是理化檢測(cè)，都很難評(píng)測(cè)茶葉中糖類物質(zhì)含量是否符合正常范圍。檢測(cè)食品單糖和雙糖的方法有化學(xué)法、液相色譜法等[6- 8]和質(zhì)譜法[ 9]。本研究開(kāi)展高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）法對(duì)茶葉中蔗糖、葡萄糖、果糖進(jìn)行測(cè)定以及T分布分析統(tǒng)計(jì)，來(lái)達(dá)到識(shí)別茶葉中糖類物質(zhì)摻雜使假鑒定的目的。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樣品：茶葉采摘于黃山休寧縣和黟縣（由黃山本地茶廠按照給定工藝加工）。

乙腈（色譜純）；超純水；固相萃取填料：石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料（Agilent, 120 μ m）。

蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99 %，百靈威）。

1.2儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent，配有1260 ELSD）；渦旋混勻器；離心機(jī)（德國(guó)Hettich）。

1.3方法

1.3.1各種溶液的配制

4種糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取0.25g蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，加水定容，配置5 mg/mL蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液。

4種糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取2 mL 蔗糖、2 mL葡萄糖、2 mL果糖和1 mL半乳糖儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3.2樣品前處理

稱取茶葉2.00 g置于50 mL離心管中，加入20 mL純水，渦旋振蕩2min，超聲處理1 min，最后離心5min（5000 rpm）。取1 mL上清液置于離心管中，加入1 mL乙腈，使用50 mg PSA固相萃取填料渦旋凈化1 min，離心5min(6000 rpm)，過(guò)0.22μ m有機(jī)系濾膜，稀釋合適的倍數(shù)進(jìn)行分析。

1.3.3色譜分析

液相色譜柱：NH2柱（5μ m，4.6×250mm，GL Sciences Inc，日本）；色譜柱溫：40℃；檢測(cè)器：蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）；流動(dòng)相：乙腈-水（70:30 （v/v））；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積：5μ L。

ELSD參數(shù)：蒸發(fā)溫度 90℃，霧化溫度 50℃，氮?dú)饬魉?.0L/min(SLM)。

2　結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相比例的選擇：流動(dòng)相比例影響流動(dòng)相的洗脫能力，水相比例越高，洗脫能力越強(qiáng)，但是分離度越低，水相比例降低，洗脫能力減小，分離度隨之增加，但是容易造成色譜峰展寬和拖尾，對(duì)靈敏度和分離效果產(chǎn)生不良影響。本研究比較了乙腈與水比例為80:20（v/v），70:30（v/v），60:40（v/v）和50:50（v/v）的分離效果，結(jié)果表明當(dāng)乙腈與水比例為70:30（v/v）分離效果和靈敏度最為理想（見(jiàn)圖1）。

2.2儀器檢出限、檢測(cè)限及線性

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖的儀器檢出限按信噪比（S/N=10）計(jì)算，蔗糖50 ug/mL，葡萄糖50 ug/mL，果糖50 ug/mL，半乳糖25 ug/mL的濃度下，其信噪比≥10；蔗糖1000 ug/mL，葡萄糖1000 ug/mL， 果糖1000 ug/mL，半乳糖1000 ug/mL的濃度下，其ELSD響應(yīng)飽和，出現(xiàn)了平頭色譜峰，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的線性范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，其線性系數(shù)≥0.995；半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的線性范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，其線性系數(shù)≥0.995。4種糖類物質(zhì)的儀器檢出限及線性范圍見(jiàn)表1。

圖1　四種糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖

表1　方法的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和檢出限

2.3前處理優(yōu)化

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖均為水溶性化合物，在水中易溶，因此選擇純水作為提取溶劑，在提取茶葉中單雙糖的同時(shí)，茶葉中的一些水溶性物質(zhì)也被提取出來(lái)，會(huì)對(duì)糖的色譜分析造成干擾，因此需要對(duì)提取液進(jìn)行凈化，茶葉中水溶性物質(zhì)主要有氨基酸、生物堿、有機(jī)酸、黃酮類物質(zhì)、花青素及茶多酚氧化產(chǎn)物茶黃素、條紅素和茶褐素，本研究考慮了不同固相萃取填料在不同的溶劑體系中的凈化效果。

2.3.1 固相萃取填料的選擇

對(duì)茶葉水溶液中的干擾物質(zhì)有吸附作用的主要有石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料，PSA吸附劑能有效去除樣品中的脂肪酸等極性基質(zhì)雜質(zhì)，C18吸附劑能去除部分非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)，石墨化碳黑能去除色素和固醇類雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同固相萃取填料對(duì)四種糖類物質(zhì)的吸附率進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明三種固相萃取填料在水或乙腈-水（1：1）中對(duì)目標(biāo)分析物無(wú)明顯吸附。但是，通過(guò)對(duì)樣品基質(zhì)加標(biāo)得到的提取溶液進(jìn)行凈化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSA對(duì)樣品基質(zhì)的凈化效果最好。

在2 mL的200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為水）分別添加50 mg PSA、C18、Carb進(jìn)行凈化處理，吸附處理結(jié)果表明：三種固相萃取填料在水溶液中對(duì)四種糖類物質(zhì)無(wú)明顯吸附。

在2 mL的200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為乙腈-水（1：1））分別添加50 mg PSA、C18、Carb進(jìn)行凈化處理，吸附處理結(jié)果表明：三種固相萃取填料在乙腈-水（1：1）溶液中對(duì)四種糖類物質(zhì)無(wú)明顯吸附。

2.3.2 提取液的溶劑體系對(duì)凈化效果影響

確定了凈化固相萃取填料后，為了降低溶劑對(duì)提取液中水溶性的雜質(zhì)的保留能力，研究往提取水溶液中加入乙腈等有機(jī)溶劑降低溶劑的極性來(lái)減少色素、有機(jī)酸和少量蛋白質(zhì)、氨基酸等水溶性雜質(zhì)在溶液中的保留強(qiáng)度，增加固相萃取填料吸附效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：往提取液中加入等體積的乙腈可以有效的增加PSA固相萃取填料對(duì)水溶性雜質(zhì)的吸附效率。

2.4檢測(cè)方法的回收率和精密度

使用正常加工得到的茶葉樣品，分別添加2%，5%和20%的蔗糖、葡萄糖和果糖以及1%，2.5%和10%的半乳糖。每個(gè)添加水平樣品平行測(cè)定7次，同時(shí)測(cè)定樣品中的糖含量，減去茶葉本身的含糖量計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(%)

3　休寧縣及黟縣夏秋茶固有含糖量統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)黃山的休寧縣和黟縣兩個(gè)主要出口茶葉地區(qū)不同地點(diǎn)進(jìn)行采樣，經(jīng)過(guò)采摘→攤涼→殺青（220℃）→揉捻→初烘（120℃，10 min）→足干（90℃，20 min）步驟進(jìn)行加工，對(duì)這兩個(gè)地區(qū)的夏秋茶樣品（樣本量均為27個(gè)）進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品均未檢出半乳糖，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

在樣品量足夠的前提下，對(duì)相同時(shí)間相同地區(qū)采摘的茶葉中的各種糖含量利用T分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)計(jì)算樣品的中位值和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果顯示：

休寧縣的夏秋茶：果糖含量的中位值為0.15 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.11 %；葡萄糖含量的中位值為0.18 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.07 %；蔗糖含量的中位值為1.07 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.43 %。

黟縣的夏秋茶：果糖含量的中位值為0.12%，標(biāo)準(zhǔn)差0.06%；葡萄糖含量的中位值為0.22 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.10 %；蔗糖含量的中位值為0.94 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.60 %。

表3　黃山地區(qū)的茶葉中含糖量的統(tǒng)計(jì)分析

4　樣品檢測(cè)分析

茶葉加糖是為了對(duì)夏秋茶進(jìn)行美化外形，由于夏秋茶的茶葉嫩度差、外形松散，通過(guò)糖的粘性特性來(lái)可以達(dá)到收縮外形的目的，也能大大提升茶葉的光澤度，更有甚者，通過(guò)添加大量的糖來(lái)達(dá)到增加茶葉的重量的目的。通過(guò)到茶葉生產(chǎn)企業(yè)調(diào)查研究，要達(dá)到收縮茶葉外形和提升茶葉的光澤度的目的，加糖量通常在5%～25%之間，因此在進(jìn)行糖添加陽(yáng)性樣品分析時(shí)，需要對(duì)提取和凈化后的溶液稀釋25倍，確保進(jìn)樣液中糖類物質(zhì)濃度在線性范圍內(nèi)再進(jìn)行色譜定量分析。

通過(guò)對(duì)出口茶葉及市場(chǎng)上的低端茶葉進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有蔗糖添加可疑樣品，檢測(cè)到的含量分別為8.92%、19.32 %、17.20 %、12.05 %、14.89 %、14.83 %、23.53 %、18.38 %、17.19 %、13.21 %、20.71 %和10.44 %，未發(fā)現(xiàn)有蔗糖含量在3%～7%之間的樣品，也未檢測(cè)果糖和葡萄糖含量異常的樣品。

以上證據(jù)表明：當(dāng)夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本確定摻加了蔗糖；當(dāng)蔗糖含量在3%～7%之間的樣品，為可疑樣品。

〔參考文獻(xiàn)〕

[1]GB 2760- 2011, 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]童小麟, 周昱. 茶葉灰分檢驗(yàn)及其控制措施[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué), 2012, 14: 33~35.

[3]張吉紅, 潘登, 余澍瓊, 等. 茶葉中摻雜小麥DNA的提取及檢測(cè)方法的比較[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(6): 148~150.

[4]湯小斌. 茶葉摻雜物中CaO、MgO的測(cè)定[J]. 福建分析測(cè)試, 2003, 12(3): 1803~1807.

[5]但悠夢(mèng), 聶光華, 王艷. 熱分析法檢測(cè)苦丁茶摻雜葡萄糖[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(10): 243~245.

[6]李會(huì)香, 許小麗, 陳惠, 等. 鹽酸普萘洛爾分子印跡電化學(xué)傳感器的制備與研究[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(6): 817~822.

[7]王浩, 劉艷琴, 楊紅梅, 等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定無(wú)糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(6): 873~876.

[8]徐秀珠, 徐根良. 糖和糖醇的高效液相色譜分析[J]. 分析化學(xué), 1999, 27(5): 547~550.

[9]張珍英, 鄧慧敏, 鄧芹英. 香豆素類新基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸_省略_時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定多糖和糖蛋白中的應(yīng)用[J]. 分析化學(xué), 2008, 36(10): 1419~1422.

（責(zé)任編輯：章傳政）

〔收稿日期〕2014-10-13

〔文章編號(hào)〕1006-5768(2015)01-0026-04

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕TS201