電針對(duì)部分雄激素缺乏綜合征大鼠睪丸P450scc/SF－1表達(dá)的影響

電針對(duì)部分雄激素缺乏綜合征大鼠睪丸P450scc/SF-1表達(dá)的影響

任毅1楊曉光1李學(xué)智1張愉2汪瑩1傅艷3

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016)

摘要〔〕目的觀察中老年部分雄激素缺乏綜合征(PADAM)大鼠睪丸細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(P450scc)和類固醇生長(zhǎng)因子-1(SF-1)的表達(dá)及電針干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，探討P450scc和SF-1在電針調(diào)節(jié)睪酮分泌過程中的作用。方法將40只雄性SD大鼠分為正常組(n=10)和造模組(n=30)，造模組腹腔注射環(huán)磷酰胺復(fù)制PADAM模型。從造模成功的大鼠中隨機(jī)選取20只分為電針組(n=10)和模型組(n=10)。電針組取“腎俞”“關(guān)元”針灸，留針15 min，每日治療1次。在第8周用ELISA分別檢測(cè)正常組、電針組和模型組大鼠血清的總睪酮(TT)、游離睪酮(FT)水平；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)P450scc蛋白表達(dá)；Western印跡檢測(cè)SF-1蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)P450scc和SF-1mRNA的表達(dá)。結(jié)果治療8 w時(shí)，ELISA結(jié)果顯示，電針組血清TT、FT水平明顯高于模型組(P<0.01)；電鏡結(jié)果顯示，電針組Leydig細(xì)胞正常，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量較模型組多；HE染色結(jié)果顯示，電針組睪丸組織中曲細(xì)精管管腔腫脹程度較模型組減輕，Sertoli細(xì)胞較模型組排列整齊；免疫組化和WB結(jié)果顯示電針組P450scc和SF-1蛋白表達(dá)較模型組升高(P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示，電針組P450scc和SF-1mRNA表達(dá)較模型組升高(P<0.01)，且兩者具有相關(guān)性(|r|≥0.8，P<0.01)。結(jié)論電針能明顯升高PADAM大鼠體內(nèi)睪酮水平，改善睪丸Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞病理表現(xiàn)。電針干預(yù)后可提高P450scc和SF-1的表達(dá)，這可能是電針治療PADAM的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞〔〕部分雄激素缺乏綜合征；電針；細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶；類固醇生長(zhǎng)因子-1

中圖分類號(hào)〔〕R245.3；R245.8〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81303036)；重慶醫(yī)科大學(xué)基金(No.XBYB2008090)

通訊作者：李學(xué)智(1973-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸治病的中樞神經(jīng)信息調(diào)控基礎(chǔ)研究。

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室

2重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心

第一作者：任毅(1988-)，男，碩士，主要從事針灸防治疾病的機(jī)制研究。

Effect of electroacupuncture on the expression of cytochrome P450 side chain cleavage and steroidogenic factor 1 in rats with partial androgen deficiency

REN Yi,YANG Xiao-Guang,LI Xue-Zhi,etal.

College of Traditional Chinese Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture (EA) intervention on expression of cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) and steroidogenic factor(SF)-1 in the testis of partial androgen deficiency of aging male (PADAM) rats so as to study its mechanism to improve testosterone.MethodsA total of 40 male Sprague Dawley rats were randomly divided into control(n=10) and building model groups(n=30),and building model group' rats were injected in abdominal cavities with cyclophosphamide to make PADAM model.PADAM model rats were randomized into EA and model groups.The serum TT and FT levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in testis were assayed by immunohistochemistry,Western blot and RT-PCR.ResultsAfter 8 weeks,the serum TT,FT levels in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).ConclusionsEA is an effective method to improve serum TT,FT levels of PADAM rats.It also could significantly improve testicular P450scc and SF-1 proteins and mRNA,which might be one of the mechanisms of EA therapy for PADAM.

【Key words】PADAM;Electroacupuncture;Cytochrome P450 side chain cleavage; Steroidogenic factor(SF)-1

電針對(duì)提高中老年男性部分雄激素缺乏綜合征(PADAM)患者雄激素水平有確切臨床療效〔1～3〕。本實(shí)驗(yàn)擬觀察電針對(duì)睪丸Leydig細(xì)胞P450scc和SF-1表達(dá)的影響，探討電針對(duì)雄激素水平的調(diào)節(jié)與P450scc及SF-1的關(guān)聯(lián)性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組2月齡、同批次SD雄性大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔質(zhì)量合格證：0002541；生產(chǎn)許可證：SYXK(渝)2012-0001〕。隨機(jī)分為2組：正常組(n=10)和造模組(n=30)。所有大鼠在相同條件(溫度20℃～24℃，濕度40%～50%，12 h光暗周期)下飼養(yǎng)1 w。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)大鼠的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2主要試劑和儀器P450scc和SF-1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記的二抗(北京康為生物試劑公司)；Taq DNA聚合酶(美國(guó)ProbeGnen公司)；總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色劑(美國(guó)Sigma公司)；總睪酮(TT)和游離睪酮(FT)試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)；環(huán)磷酰胺注射粉針(0.2g/支，批號(hào)H14023686，山西普德藥業(yè)股份有限公司)。石蠟切片機(jī)(Leica SM2000R，德國(guó))；生物顯微鏡(iMark-14047，上海)；透射電鏡(H-7500，日本)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc2000，美國(guó))。韓氏電針治療儀(北京)；針灸針(32號(hào)1寸，華佗牌)。

1.3PADAM大鼠模型制備及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考何清湖等〔4〕的方法，造模組腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d，復(fù)制PADAM大鼠模型，正常組腹腔注射等量生理鹽水。參考孫祥宙等〔5〕的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)得出正常組大鼠血清TT、FT水平的95%置信區(qū)間，造模組大鼠造模后血清TT和FT同時(shí)低于各自區(qū)間為造模成功，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4電刺激方法造模成功大鼠隨機(jī)選取20只分為電針組(n=10)和模型組(n=10)。根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕所載行穴位定位。選取“腎俞”(BL23)和“關(guān)元”(CV4)穴，采用HANS電針儀，刺激參數(shù)為連續(xù)波，頻率20～30 Hz，強(qiáng)度以保持針柄輕微顫動(dòng)為度(電流強(qiáng)度1～3 mA，電壓1～3 V)，留針15 min，連續(xù)治療8 w。正常組、模型組大鼠的固定方式和時(shí)間與電針組一致。

1.5行為學(xué)檢測(cè)各組大鼠在治療前后，參考Steru等〔7〕方法，以懸尾時(shí)間判斷大鼠肌力以及抑郁狀態(tài)；參考Mcardle等〔8〕的方法，以強(qiáng)迫游泳時(shí)間判斷大鼠的體力并衡量是否疲勞。

1.6ELISA檢測(cè)血清睪酮水平各組大鼠在治療前后分別內(nèi)眥取血2 ml，立即離心，取上清液，檢測(cè)血清TT、FT水平。

1.7透射電鏡檢測(cè)各組大鼠在治療后經(jīng)10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)深度麻醉，迅速打開陰囊，分離睪丸和附睪。右側(cè)睪丸立即放入液氮保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。左側(cè)睪丸用2.5%戊二醛原位固定0.5 h，取部分組織切成3塊1 mm×1 mm×1 mm的立方體，迅速重新置入2.5%戊二醛保存。標(biāo)本送往重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室進(jìn)行切片、鉛鈾雙重染色，H-7500型透射電鏡下觀察。

1.8HE染色左側(cè)睪丸取部分組織按上述方法制作成電鏡標(biāo)本，剩余組織置于4%多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀面切片，切片厚度4 μm，進(jìn)行HE染色。置于100倍光鏡下觀察。

1.9SABC免疫組化染色檢測(cè)P450scc蛋白表達(dá)取按上述方法制作的石蠟切片，滴加3%H2O2室溫封閉10 min，微波高溫修復(fù)抗原后冷卻至室溫；用山羊血清封閉15 min后去掉封閉液；滴加P450scc抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜；加二抗37℃孵育20 min；滴加SABC試劑，37℃孵育20 min；滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，雙蒸水沖洗，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固，置于400倍光鏡下觀察，棕黃色顆粒為免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度。

1.10Western印跡檢測(cè)SF-1蛋白表達(dá)取上述液氮保存的睪丸約40 mg，采用BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣量50 μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，加SF-1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30 min；加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)成像，用Quantity One 4.6圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.11RT-PCR檢測(cè)P450scc和SF-1 mRNA的表達(dá)取上述液氮冷凍保存的睪丸約100 mg，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書要求提取睪丸組織的總RNA；取2 μg總RNA為模板，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求合成cDNA。P450scc引物：正義序列5’-CGCTCAGTGCTGGTCAAA-3’，反義序列5’-TCTGGTAGACGGCGTCGA-3’，擴(kuò)增片段688 bp；SF-1引物：正義序列5’-TGCTCCAGTTGCATGCACCTG-3’，反義序列5’-GTTGGAAGAGTAACTCTACG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物305 bp；β-actin(作為內(nèi)參)引物序列：正義5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，反義5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，擴(kuò)增片段868 bp；引物均由重慶海韻生物技術(shù)有限公司合成。取1 μl cDNA為模板，在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件行配對(duì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析及LSD法。

2結(jié)果

2.1各組大鼠治療前后一般情況比較正常大鼠血清TT、FT的95%置信區(qū)間分別為5.56～5.60 ng/ml和4.71～4.81 nmol/L，造模組腹腔注射環(huán)磷酰胺之后，血清TT、FT均小于該區(qū)間值，表明全部造模成功。與治療前相比，治療后電針組大鼠血清TT、FT水平及強(qiáng)迫游泳時(shí)間明顯高于模型組，而懸尾時(shí)間較模型組低(P<0.01)。電針組和正常組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠治療前后一般情況比較 ± s)

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

2.2透射電鏡觀察各組大鼠Leydig細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)正常組Leydig細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。模型組曲細(xì)精管管腔明顯腫脹，Leydig細(xì)胞擠壓變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重破壞以致鏡下不可見，線粒體含量較正常組明顯減少。電針組較模型組形態(tài)規(guī)則，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量更豐富，與正常組比較無(wú)明顯差異。見圖1。

2.3HE染色觀察各組大鼠睪丸病理學(xué)改變正常組睪丸曲細(xì)精管管腔規(guī)則，基膜完整，睪丸Sertoli細(xì)胞排列整齊。模型組曲細(xì)精管管腔出現(xiàn)不同程度的腫脹，Sertoli細(xì)胞脫落缺失。電針組較模型組有明顯的改善，可見管腔腫脹程度減輕，管腔規(guī)則且基膜完整，Sertoli細(xì)胞較模型組排列整齊。見圖2。

圖1　各組大鼠Leydig細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化

圖2　各組大鼠曲細(xì)精管及Sertoli病理學(xué)變化(×100)

2.4免疫組化檢測(cè)各組大鼠睪丸P450scc蛋白的表達(dá)三組大鼠Leydig細(xì)胞內(nèi)均有P450scc的免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)，主要集中在細(xì)胞胞質(zhì)中，顯示為粗細(xì)不等的棕黃色顆粒(見圖3)。正常組(0.37±0.046)和電針組(0.36±0.031)的P450scc蛋白表達(dá)顯著高于模型組(0.25±0.036)(P<0.01)，而正常組與電針組的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3。

圖3　免疫組化檢測(cè)各組大鼠睪丸P450scc的蛋白表達(dá)(×400)

2.5Western印跡檢測(cè)各組大鼠睪丸SF-1蛋白的表達(dá)正常組(0.038±0.007 2)與電針組(0.039±0.005 6)的SF-1蛋白表達(dá)明顯高于模型組(0.022±0.004 6)(P<0.01)；電針組的SF-1蛋白表達(dá)與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4　Western印跡檢測(cè)各組大鼠睪丸SF-1的蛋白表達(dá)

2.6RT-PCR檢測(cè)各組大鼠睪丸P450scc和SF-1 mRNA的表達(dá)正常組與電針組的P450scc和SF-1 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01)；電針組與正常組表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，正常組與模型組二者具有高度相關(guān)性(|r|≥0.8，P<0.01)，而電針組與模型組存在顯著相關(guān)性(|r|>0.95，P<0.01)。見圖5，表2。

圖5　各組大鼠睪丸P450scc和SF-1 mRNA表達(dá)

組別P450sccmRNASF-1mRNAPearson相關(guān)性分析正常組0.87±0.0371)0.031±0.00391)r=0.851,P=0.002電針組0.86±0.0391)0.028±0.00411)r=0.966,P=0.000模型組0.25±0.0380.016±0.0037r=0.947,P=0.000

與模型組比較：1)P<0.01

3討論

我國(guó)PADAM發(fā)病率40歲以上為13%，50歲以上為30%，70歲以上達(dá)47%〔9〕，已嚴(yán)重影響中老年男性的身心健康。

現(xiàn)代研究表明針灸抗衰老的原理是使低表達(dá)的基因水平上調(diào)，使異常高表達(dá)的基因水平下調(diào)，從而對(duì)衰老機(jī)體紊亂的分子網(wǎng)路發(fā)揮整體的調(diào)節(jié)作用，促使基因表達(dá)恢復(fù)協(xié)調(diào)，延緩衰老進(jìn)程〔10〕。中醫(yī)認(rèn)為人的生長(zhǎng)、發(fā)育及衰老與腎臟關(guān)系最為密切，腎中所寓元?dú)馐侨松砩鼨C(jī)能的原動(dòng)力，腎精充足、腎氣旺盛才能筋強(qiáng)骨壯、髓海充足、延緩衰老?！澳I俞”出自《靈樞·背俞》，為腎中精氣輸注之處；“關(guān)元”出自《靈樞·寒熱病》，為人身元陰元陽(yáng)關(guān)藏之處；二穴相配，可補(bǔ)益腎精、溫壯元?dú)?、燮理陰?yáng)，發(fā)揮對(duì)老年男性的保健和相關(guān)疾病的治療作用。

睪酮水平下降主要原因是下丘腦-垂體-睪丸軸(HPTA)功能減退，Leydig細(xì)胞合成睪酮的能力降低〔11～13〕，而Leydig細(xì)胞合成睪酮?jiǎng)t需要限速酶進(jìn)行一系列的酶促反應(yīng)；同時(shí)，睪酮作為一種類固醇激素，其合成也需要類固醇生長(zhǎng)因子的正向調(diào)節(jié)。

P450scc是催化所有類固醇激素合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而此反應(yīng)也是類固醇激素合成的主要限速位點(diǎn)。睪丸中P450scc則只定位于Leydig細(xì)胞〔14〕。P450scc位于Leydig細(xì)胞線粒體內(nèi)膜，一方面P450scc作為載體，轉(zhuǎn)運(yùn)睪酮合成原料膽固醇到線粒體內(nèi)膜，另一方面P450scc催化同一位點(diǎn)的三個(gè)連續(xù)氧化反應(yīng)，第一步使膽固醇C22羥化；第二步使C20羥化，生成C20～22羥化膽固醇；第三步在C22和C20之間裂解，生成孕烯醇酮和乙內(nèi)酰胺，而孕烯醇酮再經(jīng)一系列的酶促反應(yīng)最終轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針可能是通過調(diào)節(jié)P450scc在睪丸中的表達(dá)從而促進(jìn)睪酮的合成與分泌。

SF-1屬于核激素受體超家族，是參與類固醇合成酶及蛋白基因調(diào)節(jié)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針通過調(diào)節(jié)睪丸SF-1的表達(dá)，從而激發(fā)CYP11A1在Leydig細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，使P450scc蛋白含量增加，最終促進(jìn)睪酮的合成與分泌。

目前，電針對(duì)雄激素分泌調(diào)節(jié)方面的研究轉(zhuǎn)變〔16，17〕，但對(duì)Leydig細(xì)胞中睪酮合成酶及蛋白表達(dá)調(diào)控因子方面的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針可以明顯提高PADAM大鼠睪丸SF-1水平，增加P450scc基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)睪酮的合成與分泌，這可能是電針促進(jìn)睪酮分泌的機(jī)制之一。

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〔2014-09-25修回〕

(編輯郭菁)