金錢草總黃酮的抗炎活性

金錢草總黃酮的抗炎活性

閻婷李益生

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的探討金錢草總黃酮提取物的體外抗炎活性。方法通過分析金錢草總黃酮提取物對(duì)5-脂氧酶(5-LOX)的抑制作用以及對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制作用，檢測(cè)金錢草總黃酮提取物抗炎作用。結(jié)果金錢草總黃酮提取物可明顯抑制脂氧酶的活性，并具有一定的T細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)論金錢草總黃酮提取物具有良好的抗炎活性，其臨床應(yīng)用的潛力巨大。

關(guān)鍵詞〔〕金錢草；總黃酮；抗炎；5-脂氧酶

中圖分類號(hào)〔〕R932〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：2012年遼寧醫(yī)學(xué)院青年科技啟動(dòng)

第一作者：閻婷(1981-)，女，講師，博士在讀，主要從事天然藥物活性成分研究。

金錢草為報(bào)春花科珍珠菜屬植物過路黃的干燥全草，味苦、酸、微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，始載于《本草綱目拾遺》〔1〕。臨床報(bào)道具有清熱解毒，利尿排石，活血散淤的作用，用于肝、膽結(jié)石，膽囊炎，黃疸性肝炎，泌尿系結(jié)石，水腫，跌打損傷；外用治化膿性炎癥，燒燙傷〔2〕。對(duì)于該藥的現(xiàn)代藥理學(xué)研究多有開展，但是多集中于該藥的臨床排石，抑菌及鎮(zhèn)痛等作用〔3〕；而對(duì)于金錢草總黃酮提取物抗炎的作用，均為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)活性〔4〕，其分子機(jī)制還未見報(bào)道。本文探討金錢草總黃酮提取物的抗炎活性。

1材料與方法

1.1試劑與動(dòng)物5-脂氧酶(5-LOX)(Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP，上海雪滿生物科技有限公司)；花生四烯酸(AA)、TMPD、Tris(Amresco公司)；實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠為藥理樣本(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2儀器Flustar微板多功能測(cè)定儀(德國BMG公司)；DHZ-D冷凍恒溫震蕩器(江蘇太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠)；MH-1型微量振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器制造)；QL-901漩渦振蕩器(江蘇海門麒麟儀器廠)；SZM F124 Ice Maker (SANYO公司)；Milli-Q Plus超純水裝置(美國Millipore公司)；PH計(jì)(梅特勒-托利多上海有限公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Costar公司)。

1.3金錢草總黃酮提取金錢草藥材加8倍量50%乙醇超聲提取3次，每次45 min，過濾，濾液經(jīng)石油醚萃取3次，取水相，濃縮，采用NKA-9型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，以20 mg/ml濃度上樣，6倍量水洗滌，50%乙醇洗脫后得到金錢草總黃酮提取液，冷凍干燥得金錢草總黃酮粉末。

1.4金錢草總黃酮對(duì)5-LOX的抑制作用AA先被5-LOX催化生成5-羥基過氧四烯酸，經(jīng)辣根過氧化酶(HPR)以5-羥基過氧四烯酸和TMPD為底物作用生成600 nm處有吸收的物質(zhì)。96孔板分別加入空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M中每孔加入Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)190 μl和10 μl的HPR；對(duì)照組每孔加170 μl的 Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR(700 μg/ml)；實(shí)驗(yàn)組每孔中加入160 μl的Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的總黃酮提取物、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR 700 μg/ml。輕輕振搖96孔板混勻溶液，37℃孵育10 min。加樣孔中加入10 μl的TMPD(2.8 mg/ml)。加樣孔中再加入10 μl的AA。輕輕振搖96孔板混勻溶液，25℃孵育。酶標(biāo)儀設(shè)置600 nm處讀取OD值。金錢草總黃酮濃度設(shè)置高、中、低三個(gè)劑量，分別為1、0.1、0.01 mg/ml。

1.5金錢草總黃酮對(duì)小鼠T細(xì)胞的增殖抑制作用托頸處死小鼠，75%酒精浸泡1 min，超凈臺(tái)上解剖取出脾臟，去除結(jié)締組織后PBS漂洗。置于裝有完全DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%雙抗)的一次性平皿中，無菌注射器將脾臟一端扎幾個(gè)小孔后，注射器吸取完全DMEM培養(yǎng)基從脾臟另一端扎入并將脾臟內(nèi)細(xì)胞吹出，反復(fù)幾次。淋巴細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄去上清后加紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，反復(fù)幾次直至紅細(xì)胞全部裂解。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。配制2×109個(gè)/L的淋巴細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入100 μl淋巴細(xì)胞懸液和10 μl的待測(cè)藥物，5%CO2、37℃孵育60 min，再加入10 μl的Con A(終濃度為10 μg/ml)，同上條件孵育48 h。每孔均加入MTT(濃度5 mg/ml)10 μl，同上條件孵育4 h后，去掉上清，加入DMSO 100 μl，微量震蕩后酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的OD值。藥物濃度分別1 000、100、10、1、0.1 μg/ml。抑制率%=1-OD加藥/OD對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1金錢草總黃酮對(duì)5-LOX的抑制作用0.01、0.1、1 mol/ml的金錢草總黃酮對(duì)5-LOX的抑制率分別為2.5%、53.7%及70.5%。

2.2金錢草總黃酮對(duì)小鼠T細(xì)胞的增殖抑制作用見表1。在總黃酮濃度為0.1 mg/ml時(shí)，金錢草總黃酮呈現(xiàn)了微弱的抑

表1　金錢草總黃酮對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用 ± s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

制趨勢(shì)，而隨著濃度的上升，其抑制能力也顯著上升，當(dāng)總濃度達(dá)到10 mg/ml時(shí)，體系的抑制效率同對(duì)照組相比呈現(xiàn)了明顯的差異，表明金錢草總黃酮有明顯抗炎活性。

3討論

臨床上對(duì)于該藥的利用多為排石，如方劑中的復(fù)方金錢草顆粒，膽寧片等〔5，6〕。一般認(rèn)為金錢草的功效為清熱利濕及通淋，其相應(yīng)的藥理作用則可能在于對(duì)膽囊的促進(jìn)及對(duì)人體成石率的抑制，并提高患者的腎臟系數(shù)。同時(shí)，針對(duì)尿道感染，金錢草也可起到相應(yīng)的作用，楊寧寧等〔7〕研究表明，金錢草對(duì)于下尿路的感染效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的阿莫西林。但是對(duì)于金錢草抗炎的研究，仍然僅針對(duì)動(dòng)物的體外實(shí)驗(yàn)，而對(duì)機(jī)制層面的研究不多。對(duì)于其抗炎作用的解釋僅僅從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論中的利濕角度出發(fā)〔8〕，但是尚未解釋金錢草總黃酮在此過程中的作用。同時(shí)，大量的藥理研究表明，黃酮類物質(zhì)擁有良好的抗炎藥理學(xué)活性〔9〕。而作為金錢草的主要成分，總黃酮與金錢草的種種活性密切相關(guān)，但是對(duì)于金錢草總黃酮的研究仍然是清除結(jié)石〔10〕，而對(duì)于其與抗炎活性的相關(guān)性研究尚顯不足?？梢酝茰y(cè)，金錢草或其相關(guān)成藥中的總黃酮，在其抗炎機(jī)制中會(huì)起到一定的作用。

作為一種長(zhǎng)單鏈蛋白質(zhì)，5-LOX廣泛的存在于動(dòng)植物的組織中。在人等哺乳動(dòng)物體內(nèi)，5-LOX可將AA氧化成5-羥基四烯酸和5-羥基過氧四烯酸(5-HPETE)最終生成白三烯類化合物。同時(shí)，導(dǎo)致血管通透性增加、血漿外滲，引起平滑肌尤其是支氣管平滑肌收縮，引起支氣管哮喘。而本模型的原理則是AA先被5-LOX催化氧化生成5-羥基過氧四烯酸，然后HPR以5-羥基過氧四烯酸和TMPD為底物生成一種物質(zhì)，并在610 nm處產(chǎn)生吸收。再通過反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)下吸收值的不同，確定相應(yīng)提取物對(duì)于脂氧酶的抑制作用。本研究則主要測(cè)試了金錢草總黃酮的抗炎作用，這與臨床報(bào)道〔7〕是相符的。但是，該報(bào)道僅從金錢草總黃酮的抗菌作用角度出發(fā)，而筆者的研究則從分子角度對(duì)該結(jié)果進(jìn)行闡述，并由此推論，金錢草的抗感染療效是抑菌同抗炎相結(jié)合的雙重作用的結(jié)果。特別是金錢草中的黃酮，在抗炎的過程中發(fā)揮了巨大的作用。

金錢草可以有效地抑制脂氧酶活性，并產(chǎn)生了顯著的抗炎作用，為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，進(jìn)行了抑制小鼠體外T淋巴細(xì)胞抗炎的實(shí)驗(yàn)。淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)的主要免疫細(xì)胞，而其中的T細(xì)胞擁有細(xì)胞免疫功能，然而其過度的增殖，則會(huì)介導(dǎo)某些自身免疫性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斑禿及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。同時(shí)，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理環(huán)節(jié)中，T細(xì)胞也起到了重要的作用〔11〕。同時(shí)，在正常及病理性應(yīng)答條件下，T細(xì)胞的活化在免疫應(yīng)答中有著關(guān)鍵的作用〔12〕?；诖耍窘Y(jié)果表明，金錢草總黃酮對(duì)小鼠的T細(xì)胞有著特異性的抑制作用，特異性的抑制T細(xì)胞的活化程度，可以對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病起到明顯的治療作用，且對(duì)各種過敏性疾病也可以起到防治作用。

本文通過對(duì)金錢草總黃酮提取物的細(xì)胞藥理分析發(fā)現(xiàn)，金錢草總黃酮可以有效地抑制5-LOX的活性，并抑制小鼠體外T細(xì)胞的增殖，體系體現(xiàn)出顯著的抗炎作用。然而，由于中藥的復(fù)雜性，特別是復(fù)方的綜合作用，金錢草的抗炎作用不僅僅是總黃酮的單一作用，其他的單體成分也會(huì)對(duì)其抗炎產(chǎn)生協(xié)同作用。本文從黃酮類化合物的抗炎特性出發(fā)，確定了金錢草總黃酮抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝機(jī)制，為臨床用藥及進(jìn)一步的研究提供了新的思路，而對(duì)其全面的抗炎活性，需綜合臨床效果及其他藥理模型進(jìn)一步確認(rèn)。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)