抑菌圈法研究幾種硫酸抗敵素抑菌性能

戴五洲，陳寶國，李順，鄭云林*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.江西通用技術(shù)工程學(xué)校）

抑菌圈法研究幾種硫酸抗敵素抑菌性能

戴五洲1，陳寶國2，李順1，鄭云林1*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.江西通用技術(shù)工程學(xué)校）

本試驗旨在研究不同硫酸抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌種的抑菌性能。試驗選取9塊TSA無菌平皿，分成3組，分別做好標記為：大-A、大-B、大-C；沙-A、沙-B、沙-C；葡-A、葡-B、葡-C。用無菌膠頭滴管在每塊平皿上均勻打6個大小深度相同的孔，每組分別用不同濃度（1600mg/L、800mg/L、400mg/L、200mg/L、150mg/L、100mg/L）的A、B、C 3種硫酸抗敵素檢驗其對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌種的抑菌效果。結(jié)果表明：A、B、C三種抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌有抑制效果，對葡萄球菌無明顯抑制效果。其中A抗敵素抑菌效果明顯好于B、C抗敵素，B、C抗敵素抑菌效果差異不明顯。只有A抗敵素在符合國家農(nóng)業(yè)部添加標準的情況下有較好的抑菌效果。

硫酸抗敵素；大腸桿菌；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌

硫酸抗敵素又名硫酸黏桿菌素、多黏菌素E，是從多黏芽胞桿菌變種(Bacillus polymyxa var colistimus)培養(yǎng)液中提取的一種堿性多肽類抗生素。其內(nèi)服不易吸收不易產(chǎn)生耐藥性。對革蘭氏陽性菌和真菌無作用，治療時常與抗革蘭氏陽性菌的桿菌膚合用；用作飼料添加劑可刺激幼畜生長，提高飼料效率，防止肉雞、豬、牛等畜禽傳染性腸炎；防治大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病。硫酸抗敵素應(yīng)用于斷奶仔豬，具有減少仔豬腹瀉、促進生長及提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用。

國家農(nóng)業(yè)部規(guī)定硫酸粘菌素允許添加量為2～20mg/L，而配方師在實踐生產(chǎn)中往往超劑量添加，否則達不到抗拉稀效果。本實驗旨在通過對市場上硫酸粘菌素含量為10%的預(yù)混料產(chǎn)品抑菌性能效果的研究，篩選符合國家農(nóng)業(yè)部法規(guī)并且達到抑菌效果的抗生素產(chǎn)品，現(xiàn)論述如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌種由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院實驗室提供。

1.1.2 試驗藥品。A、B、C三種硫酸抗敵素均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院實驗室提供，含量均≥10%。

1.1.3 實驗器械和儀器。器械：試管，燒杯，涂布棒，錐形瓶，玻璃棒，小玻璃瓶，250mL容量瓶，500mL量筒，pH試紙，接種環(huán)，20uL、200uL、1 000uL移液槍與槍頭，90mm平皿，酒精燈等，均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院實驗室提供。

儀器：JN037328型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、HS.Z11.5型電熱蒸餾水器（上海躍進醫(yī)療器械廠）、DHG-9101.3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（揚州市三發(fā)電子有限公司）、BS600+型電子天平（上海友聲衡器有限公司）、SPX-150Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SHK-99-11型臺式空氣恒溫搖床（北方同正）、CD-212MBS型冷藏冷凍箱（容聲（中國）電器有限公司）、SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）。

1.2 實驗的準備

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸餾水1 000mL。按照培養(yǎng)基配方比例，依次準確稱取所需量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl，并準確量取所需體積蒸餾水，置于錐形瓶中，用玻璃棒攪拌可適當(dāng)加熱使藥品全部溶化，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6之間。加塞，包扎，115℃高壓滅菌30min，室溫保存。

1.2.2 無菌平皿的制備。加熱使保存的LB固體培養(yǎng)基完全融化，在冷卻至50℃左右時傾注于90mm無菌平皿，每平皿約傾注15～20mL，待凝固完全即可使用。

1.2.3 麥氏單位比濁管的配制。選定管徑與制備菌液管徑相同的試管，量取濃度為1%的稀硫酸9.8mL于選定試管中，另取濃度為0.25%的氯化鋇溶液0.2mL緩慢滴加至稀硫酸溶液中混勻，用半徑為1cm比色杯在紫外分光光度計上以625nm測定其吸光度值，0.5麥氏單位比濁管的吸光度值應(yīng)該在0.08～0.1之間為合格，檢測合格后封口，4℃保存。比濁管每次使用前用力搖勻，每次使用時復(fù)驗比濁管濁度。

1.2.4 抗敵素藥液的配制。A型抗敵素：稱取400mg A型抗敵素，用50mL滅菌蒸餾水溶解，移液至250mL容量瓶，定容至刻度線，配成濃度為1 600mg/L的初始溶液。取6個小玻璃瓶，用移液槍分別移入4mL、2 mL、1mL、0.5mL、0.3mL、0.25mL初始溶液，再用移液槍分別移入0mL、2mL、3mL、3.5mL、2.9mL、3.75mL蒸餾水，配成濃度分別為1 600mg/L、800mg/L、400 mg/L、200mg/L、150mg/L、100mg/L的A型抗敵素藥液，分別標記為A1600、A800、A400、A200、A150、A100。

B、C型抗敵素：根據(jù)以上同樣方法配好濃度分別為1 600 mg/L、800 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、150 mg/L、100mg/L的B、C型抗敵素溶液并標記。

制作完成后用紙盒裝好，放入冷藏室冷藏備用。

1.2.5 菌液的制備

1.2.5.1 菌種的復(fù)蘇。將4℃保存的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時間后，使用LB瓊脂平皿重新劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌落生長情況。

1.2.5.2 菌液的制備。取復(fù)壯后的3種菌種，選擇外觀形態(tài)良好的單個菌落鉤菌接種至10mL的LB無菌平皿中，37℃振搖培養(yǎng)6～9h，用滅菌的接種環(huán)勾取形態(tài)良好無污染的菌落分別接種至裝有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，稀釋到0.5麥氏比濁度，使三種細菌生長濁度達到1×108。將此細菌培養(yǎng)液作為種子液，并在短時間內(nèi)使用。

1.3 試驗菌對3種抗敵素的抑菌圈實驗

1.3.1 涂布平皿。取9塊TSA無菌平皿，分成3組，分別標記為：大-A、大-B、大-C；沙-A、沙-B、沙-C；葡-A、葡-B、葡-C。用無菌移液槍分別移取三種細菌種子液200uL，根據(jù)標記均勻滴到3組無菌平皿內(nèi)，再用涂布棒涂勻，注意在此過程中注意涂布棒的消毒，避免交叉感染細菌或者感染雜菌。完成后放入37℃恒溫箱烘干培養(yǎng)30min。

1.3.2 平皿打孔。取出9塊烘干培養(yǎng)后的平皿，用無菌膠頭滴管在每塊平皿上均勻打6個大小深度相同的孔（如圖1、2、3），用酒精燈對每個孔進行燙底。分別對每個孔標號為1、2、3、4、5、6。

圖1 A、B、C三種抗敵素對大腸桿菌的抑菌圈實驗

圖2 A、B、C三種抗敵素對沙門氏菌的抑菌圈實驗

圖3 A、B、C三種抗敵素對葡萄球菌的抑菌圈實驗

1.3.3 接種藥物。用20uL無菌移液槍在A號平皿中的1～6號孔分別滴入20 uL的A100、A150、A200、A400、A800、A1600瓶內(nèi)的抗敵素溶液；同樣再在B號平皿中的1～6號孔分別滴入20uL的B100、B150、B200、B400、B800、B1600瓶內(nèi)的抗敵素溶液;在C號平皿中的1～6號孔分別滴入20 uL的C100、C150、C200、C400、C800、C1600瓶內(nèi)的抗敵素溶液。其中序號為1、2的孔滴入的為國家農(nóng)業(yè)部規(guī)定濃度范圍內(nèi)的抗敵素溶液。

1.3.4 細菌的培養(yǎng)。將涂布好菌液且接種好藥物的平皿放入37℃恒溫箱培養(yǎng)8～9h。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈試驗結(jié)果

不同濃度的A、B、C 3種抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌抑菌圈實驗抑菌圈直徑大小值見表1。

2.2 實驗結(jié)果分析

由1表可知，在國家農(nóng)業(yè)部規(guī)定濃度內(nèi)，A抗敵素對大腸桿菌及沙門氏菌有明顯抑菌效果，對葡萄球菌無明顯抑菌效果；B、C抗敵素僅在濃度為200 mg/L時對大腸桿菌、沙門氏菌有少許抑菌效果，對葡萄球菌無明顯抑菌效果；在濃度為400mg/L、800mg/ L時，A、B、C三種抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌均有明顯抑菌效果且A抗敵素效果明顯好于B、C抗敵素，對葡萄球菌無明顯抑菌效果；在濃度為1 600mg/ L時，A、B、C三種抗敵素抑菌對大腸桿菌、沙門氏菌抑菌效果好且不同藥品間無明顯差異；A、B抗敵素對葡萄球菌有輕微抑菌效果，C抗敵素對葡萄球菌仍無明顯抑菌效果。同時表1表明，抗敵素對革蘭氏陰性菌抑菌效果在一定的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大而增大，對革蘭氏陽性菌幾乎無抑菌效果。

表1 不同濃度的A、B、C三種抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌抑菌圈實驗抑菌圈直徑大小mm

3 討論

3.1 抑菌性能試驗

抑菌性能試驗是指在體外測定藥物抑菌或殺菌的能力，可為臨床選擇敏感藥物治療感染性疾病提供依據(jù)，也可了解細菌的耐藥情況。目前常用方法有抑菌圈法、薄膜密貼法、最小抑菌濃度法和細菌總數(shù)測定法等，抑菌圈測量是利用抑菌物質(zhì)在涂布特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)成球形立體狀擴散，抑制試驗菌的繁殖，在抑菌物質(zhì)的周圍形成透明圈，即抑菌圈。它是微生物分析的經(jīng)典方法，有簡單、便捷、準確的優(yōu)點。

3.1.1 影響抑菌性能試驗結(jié)果的因素

3.1.1.1 菌液的濃度。測定某種細菌對于抗菌藥物的敏感性前，首先應(yīng)將試驗菌配制成一定濃度的菌懸液，使最終的試驗菌液生長濁度約為1×108。如果菌液濃度過高，則可能導(dǎo)致對該菌敏感的藥物也不能抑制其生長或殺滅，使抑菌圈過小而無法篩選出效果更好的藥品。

3.1.1.2 培養(yǎng)基的選擇?？捎糜谒幟粼囼灧治龅呐囵B(yǎng)基種類較多，然而不同的細菌對于培養(yǎng)基的需求不同，本次實驗中大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求低，在LB固體培養(yǎng)基中生長良好，為了使實驗方便同時具有可比性，本次實驗3種實驗菌均使用LB培養(yǎng)基。

3.1.1.3 細菌培養(yǎng)條件。細菌的生長繁殖除了需要符合要求的營養(yǎng)條件外，還與溫度、pH等有關(guān)。

溫度：溫度對于細菌的生長有著極為重要的影響，適合的溫度可使細菌迅速生長繁殖。標準實驗操作規(guī)程中所要求的溫度較為固定，一般為37℃。

pH：適合的pH是細菌代謝和繁殖的基本條件，大多數(shù)細菌生長的最適pH值為7.2～7.4，因菌種不同略有差異。pH調(diào)節(jié)應(yīng)在培養(yǎng)基配制階段進行，培養(yǎng)基pH不僅影響細菌的生長，同時還可影響藥物的穩(wěn)定性和活性，對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。例如，在堿性環(huán)境中可使氨基糖苷類抗生素的抗菌作用增強[5]。本次實驗采用的pH范圍在7.2～7.4之間，符合細菌生長繁殖需求，同時對抗菌藥物穩(wěn)定性和活性的影響不大。

3.1.1.4 抗菌藥液的配制。硫酸抗敵素易溶于水且理化性質(zhì)穩(wěn)定，但是本實驗的3種藥品粉碎程度和載體度不同，故在配制溶液前應(yīng)先將其碾壓成粉碎度相差不大，在溶液的配制過程中，應(yīng)使溶質(zhì)充分溶解。

3.2 細菌的耐藥性

幾乎每一種細菌接觸抗菌藥物后都會產(chǎn)生抗菌藥物耐藥，但在抗菌藥物的選擇壓力下，大部分敏感細菌被殺滅，但少數(shù)細菌會發(fā)生耐藥性變異，以求適者生存。

本次實驗結(jié)果顯示，選用的3種細菌均為對抗敵素?zé)o抗藥性或者抗藥性弱的菌種。

4 結(jié)論

A、B、C3種抗敵素對大腸桿菌、沙門氏菌有抑制效果，對葡萄球菌無明顯抑制效果。其中A抗敵素抑菌效果明顯好于B、C抗敵素，B、C抗敵素抑菌效果差異不明顯。只有A抗敵素在符合國家農(nóng)業(yè)部添加標準的情況下有較好的抑菌效果。

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1004-2342（2015）02-0010-04

S859.79+6

B

2015-03-26）

戴五洲（1990～），男，江西省永修人，在讀碩士，從事動物營養(yǎng)與疾病防控的研究。E-mail：396870216@qq. com。

*通訊作者：鄭云林,男，碩士生導(dǎo)師，從事畜禽養(yǎng)殖技術(shù)研究。