熒光光譜法研究蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA的相互作用

付銀環(huán)，付彩霞

（1.無棣第一中學(xué)生物學(xué)科，山東無棣251900；2.濱州醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，山東煙臺264003）

蘇丹屬于含苯類偶氮染色劑，具有潛在的致癌性［1－4］，我國禁止其作為食品添加劑。作者在pH 值為7.4的Tris－HCl緩沖溶液中，利用熒光光譜法研究蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 之間的作用模式和作用機(jī)制，測定了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)，擬為從分子水平研究蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的相互作用提供幫助。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

鯡魚精DNA，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；蘇丹Ⅳ、Tris，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；1.6×10－3mol·L－1鯡魚精DNA 儲備液（用Tris－HCl緩沖溶液配制）；1.0×10－3mol·L－1蘇丹Ⅳ儲備液（用無水乙醇配制）；0.05 mol·L－1pH 值7.4 的Tris－HCl緩沖溶液（含0.1 mol·L－1NaCl）；0.01 mol·L－1KI溶液。

LS－45／55型熒光／磷光／發(fā)光分光光度計，美國Perkin Elmer公司；PHS－3C型酸度計，上海雷磁儀器廠；電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器有限公司；KQ－500B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；BP211D 型電子分析天平，上海精密儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜

移取2.00 mL 蘇丹Ⅳ溶液于1cm 石英比色皿中，依次加入不同量的鯡魚精DNA，搖勻，分別在22 ℃、37 ℃下靜置5 min，掃描熒光光譜。Δλex＝5 nm、Δλem＝5nm，激發(fā)波長為650nm，熒光掃描范圍為630～670nm。

1.2.2 單、雙鏈DNA 作用的比較實驗

單鏈DNA（ssDNA）的制備：將雙鏈DNA（dsDNA）加至10mL比色管中，置于沸水浴中加熱30min后，迅速放到冰水浴中冷卻，即得到ssDNA。

于兩組5mL比色管中依次加入2.00mL蘇丹Ⅳ溶液，分別加入不同量的ssDNA 溶液和dsDNA 溶液。搖勻，在22 ℃下靜置5min，掃描熒光光譜，記錄650nm 處的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 KI熒光猝滅實驗

在1cm 比色皿中加入2.00 mL 蘇丹Ⅳ溶液，再加入100μL鯡魚精DNA，搖勻，再加入不同量的KI溶液，搖勻，在22 ℃下靜置5min，記錄650nm 處的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 鯡魚精DNA對蘇丹Ⅳ熒光光譜的影響

蘇丹Ⅳ具有較大的平面芳香環(huán)，在Tris－HCl緩沖溶液中受到激發(fā)能發(fā)射熒光。圖1是295K時鯡魚精DNA 對蘇丹Ⅳ熒光光譜的影響。

圖1 295K 時鯡魚精DNA對蘇丹Ⅳ熒光光譜的影響Fig.1 Effect of herring sperm DNA on fluorescence spectra of Sudan Ⅳat 295K

由圖1可知，蘇丹Ⅳ的最大發(fā)射波長為650nm；隨著鯡魚精DNA 濃度的增大，蘇丹Ⅳ的熒光強(qiáng)度不斷減弱，表明蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 之間發(fā)生了相互作用［5－6］，鯡魚精DNA 能猝滅蘇丹Ⅳ的內(nèi)源性熒光。

2.2 鯡魚精DNA 對蘇丹Ⅳ的熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同可分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅，可用Stern－Volmer方程［7－8］表示：

式中：F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時的熒光強(qiáng)度；cDNA為猝滅劑濃度；KSV為猝滅常數(shù)；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均熒光壽命（10－8s）；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)。以F0／F對cDNA作不同溫度下的Stern－Volmer曲線（圖2），斜率即為KSV。

按式（1）及圖2計算295K、310K 下蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 相互作用的熒光猝滅常數(shù)和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

由表1可知，Kq遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)2.0×1010L· mol－1·s－1，且Kq隨著溫度的升高而減小。表明，鯡魚精DNA 對蘇丹Ⅳ的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅。

圖2 295K 和310K 下鯡魚精DNA對蘇丹Ⅳ熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer curves for the fluorescence quenching of Sudan Ⅳby heering sperm DNA at 295K，310K

表1 295K 和310K 下蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA相互作用的熒光猝滅常數(shù)和相關(guān)系數(shù)Tab. 1 Fluorescence quenching constants and the correlation coefficients for interaction between Sudan Ⅳand heering sperm DNA at 295K，310K

2.3 蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 之間相互作用的結(jié)合常數(shù)（KA）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）可由式（2）［9］計算：

以lg［（F0－F）／F］對lgcDNA作圖，通過斜率和截距求出蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA相互作用的相關(guān)參數(shù)Tab.2 Related parameters for the interaction between Sudan Ⅳand herring sperm DNA

由表2可知，蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的結(jié)合常數(shù)KA數(shù)值較大，故蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 間存在較強(qiáng)的相互作用，且隨溫度的升高結(jié)合能力下降。

2.4 蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的相互作用力類型

藥物小分子和生物大分子之間的作用力主要有氫鍵、靜電作用力、范德華力、疏水作用力［10－11］。根據(jù)熱力學(xué)公式（3）、（4）、（5）計算不同溫度下的結(jié)合常數(shù)及ΔH、ΔS、ΔG，結(jié)果見表2。

根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷藥物小分子與生物大分子之間的主要作用力類型［12］：ΔH＞0、ΔS＞0，主要為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，主要為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0，主要為靜電作用力。

由表2可以看出，蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的相互作用是自發(fā)的（ΔG＜0）；主要作用力是氫鍵和范德華力（ΔH＜0、ΔS＜0）。

2.5 單、雙鏈DNA作用的比較實驗

研究表明，小分子與DNA 作用主要存在3 種結(jié)合模式：嵌插結(jié)合、溝槽結(jié)合、靜電作用［13－14］。本實驗通過研究ssDNA 和dsDNA 對蘇丹Ⅳ的熒光猝滅作用來研究蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 相互作用的結(jié)合模式。如果蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 相互作用通過嵌插結(jié)合，則ssDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)比dsDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)小，嵌插結(jié)合時dsDNA 的結(jié)構(gòu)會被破壞，而ssDNA 的結(jié)構(gòu)則不會被破壞；如果通過溝槽結(jié)合，則ssDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)比dsDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)大；如果通過靜電作用，則ssDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)和dsDNA 對蘇丹Ⅳ猝滅常數(shù)相同。

圖3是單、雙鏈DNA 對蘇丹Ⅳ的熒光猝滅Stern－Volmer曲線。

圖3 單、雙鏈DNA對蘇丹Ⅳ的熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig.3 Stern－Volmer curves for fluorescence quenching of Sudan Ⅳby ssDNA and dsDNA

由圖3可知，ssDNA 和dsDNA 均能猝滅蘇丹Ⅳ的熒光，但是ssDNA 對蘇丹Ⅳ的猝滅程度更強(qiáng)，說明蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的結(jié)合模式是溝槽結(jié)合。

2.6 KI熒光猝滅實驗

KI作為一種強(qiáng)猝滅劑，也可用來研究蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 相互作用的結(jié)合模式。當(dāng)小分子與DNA以嵌插結(jié)合模式發(fā)生作用時，小分子嵌插到DNA 螺旋雙鏈的堿基之間，DNA 可以保護(hù)小分子，防止小分子的熒光被KI猝滅。然而當(dāng)小分子與DNA 以溝槽結(jié)合模式發(fā)生作用時，小分子會部分受到DNA 的保護(hù)，KI只能在一定程度上猝滅小分子的熒光。

圖4是KI對蘇丹Ⅳ熒光強(qiáng)度的影響。

圖4 KI對蘇丹Ⅳ熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of KI on fluorescence intensity of Sudan Ⅳ

由圖4可看出，加入鯡魚精DNA 后，KI的猝滅常數(shù)變大了，說明蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的相互作用是通過溝槽結(jié)合實現(xiàn)的［15］。

3 結(jié)論

在pH 值為7.4的Tris－HCl緩沖溶液中，采用熒光光譜法研究了蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 的相互作用。結(jié)果表明，蘇丹Ⅳ通過溝槽結(jié)合模式與鯡魚精DNA發(fā)生作用；鯡魚精DNA 能猝滅蘇丹Ⅳ的內(nèi)源性熒光，其機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅。通過Scatchard方程求得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，熱力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)表明，蘇丹Ⅳ與鯡魚精DNA 之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。

［1］STIBOROVA M，SCHMEISER H H，F(xiàn)KEI E.Prostaglandin H synthase－medicated oxidation and binding to DNA of a detoxication metabolite of carcinogenic SudanⅠ，1－（phenylazo）－2，6－dihydroxynapthalene［J］.Cancer Lett，1999，146（1）：53－60.

［2］STIBOROVA M，F(xiàn)REI E，SCHMEISER H H.Detoxication products of the carcinogenic azodye SudanⅠ（Solvent Yellow 14）bind to nucleic acids after activation by peroxidase［J］.Cancer Lett，1993，68（1）：43－47.

［3］楊煬.蘇丹紅Ⅳ對大鱗副泥鰍和泥鰍的毒性研究［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2012.

［4］郎朗，于蕾，鄒翔.蘇丹紅Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ致小鼠氧化損傷的實驗研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，21（6）：687－689.

［5］MODUKURU N K，SNOW K J，PERRIN B S，et a1.Contributions of a long side chain to the binding affinity of an anthracene derivative to DNA［J］.J Phys Chem B，2005，109（23）：11810－11818.

［6］KASHANIAN S，DOLATABADI J E N.Invitrostudy of calf thymus DNA interaction with butylated hydroxyanisole［J］.DNA Cell Biol，2009，28（10）：535－540.

［7］陳國珍，黃賢智，鄭朱梓，等.熒光分析法［M］.第二版.北京：科學(xué)出版社，1990：64－86.

［8］楊曼曼，席小莉，楊頻.變溫下熒光猝滅和加強(qiáng)理論公式合理性的比較［J］.化學(xué)學(xué)報，2006，64（14）：1437－1445.

［9］付彩霞，劉明鷺，張懷斌，等.光譜法研究Zn（Ⅱ）存在下環(huán)丙沙星與DNA 的相互作用［J］.化學(xué)與生物工程，2012，29（1）：39－41.

［10］BRAUN A M，MAURETTE M T.Photochemical Technology［M］.New York：Oliveros E Wiley，1991：41.

［11］LIU B S，XUE C L，WANG J，et al.Study of the conjugation reaction between bovine serum albumin and gentamicin with Pon－ceau S as fluorescence probe［J］.Monatsh Chem，2012，143（2）：203－209.

［12］ROSS D P，SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions：Forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20（11）：3096－3102.

［13］于婷婷，何平，梁艷，等.有機(jī)藥物分子與DNA 相互作用的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21（7）：937－944.

［14］崔鳳靈，霍瑞娜，張貴生，等.抗癌藥物4′－O－（α－L－夾竹桃糖基）柔紅霉素與小牛胸腺DNA 的相互作用的熒光光譜［J］.應(yīng)用化學(xué)，2012，29（2）：238－244.

［15］張諾，吳丹，韓顏顏，等.核酸與有機(jī)小分子反應(yīng)機(jī)理的熒光特性研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（6）：1545－1548.