熒光分析法研究水楊酸磺胺類似物與牛血清白蛋白的作用機制

廖乙媚，陳 虹，秦 箐，，莫建赧，劉布鳴，蒙法艷，周朝霞，林翠梧

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西南寧530021；2.廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004；3.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西南寧530022；4.廣西中藥質量標準重點實驗室，廣西南寧530022；5.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院，廣西南寧530023）

板藍根來源于草大青、植物馬藍、菘藍的干燥根，是中國常用的中藥材?？捎糜陬A防感冒、咽喉疼痛等，研究表明板藍根還具有抗病毒、抗菌、增強免疫功能的作用。在我們前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，板藍根與免疫抑制劑聯(lián)用能延長心臟移植手術小鼠的生存時間［1－2］。從板藍根中提取分離出的水楊酸可廣泛用于治療病毒性和細菌性感染。水楊酸磺胺類似物4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺間甲氧嘧啶（類似物Ⅰ）、4－（2－羥基苯甲酰）氨基磺胺間甲氧嘧啶（類似物Ⅱ）、4－（2－羥基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（類似物Ⅲ）、4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（類似物Ⅳ）是以水楊酸和磺胺為原料合成的新化合物，結構見圖1。

圖1 水楊酸磺胺類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子結構Fig.1 Molecular structures of analogue of salicylic acid－sulfonamidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ

血清白蛋白（SA）在哺乳動物體內(nèi)起著重要的貯存和運輸作用［3］，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結合。從不同角度研究其與藥物的相互作用，對闡明藥物的運輸與代謝過程及了解蛋白質的結構與功能起著重要作用［4］。作者以牛血清白蛋白（BSA）與系列水楊酸磺胺類似物為研究對象，建立水楊酸磺胺類似物－BSA 的作用體系，采用分子熒光分析法和同步熒光猝滅法研究水楊酸磺胺類似物－BSA 作用體系的結合常數(shù)、結合位點及相應的熱力學常數(shù)等，以闡明水楊酸磺胺系列類似物在體內(nèi)的運輸和代謝過程，為進一步的生物學研究提供重要的實驗依據(jù)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，98%），合肥博美Sigma分裝；水楊酸磺胺類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，本實驗室合成；二甲基亞砜，BR，廣東光華化學廠有限公司。

牛血清白蛋白用蒸餾水配制成1×10－4mol·L－1儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。Tris－HCl緩沖溶液（pH＝7.4，離子濃度0.1mol·L－1）。水楊酸磺胺類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ取適量分別溶于5mL 二甲基亞砜，分別用Tris－HCl緩沖溶液稀釋成1×10－4mol·L－1的標準溶液。

RF－5301PC型熒光分光光度計，日本島津；FE20型精密pH 計、PB602－N 型電子天平，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；AG245型電子分析天平，瑞士梅特勒公司；DF－101S型集熱式恒溫加熱器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；移液槍，上海科華系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

分別準確吸取一定體積的水楊酸磺胺類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標準溶液于對應的10 mL 比色管中，加入1mL的BSA 儲備液，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋到10mL。分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃恒溫水浴下，設置激發(fā)波長λex＝295nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度為快速，靈敏度位高，在發(fā)射波長λem＝300nm 時測定發(fā)射光譜。設定發(fā)射和激發(fā)波長差為Δλ＝15nm 和Δλ＝60nm，分別掃描系列類似物－BSA體系在25 ℃時的同步熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 類似物－BSA作用體系的熒光猝滅光譜

BSA 由于其自身的色氨酸殘基和酪氨酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源熒光。在實驗設定條件下，固定BSA 的量，逐漸增加類似物的量，測定系列類似物－BSA 作用體系發(fā)生結合反應后的熒光強度，結果如圖2所示。

圖2 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由圖2 可知，系列類似物－BSA 作用體系在345 nm 左右有最強峰，且隨著類似物濃度的增加，BSA 的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，說明系列類似物均能與BSA 產(chǎn)生相互作用，導致熒光猝滅反應的發(fā)生。

2.2 熒光猝滅機理的確定

熒光猝滅通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［5］，動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，其作用過程遵循Stern－Volmer方程［6］：

式中：F0和F分別為加入類似物前后BSA 的熒光強度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；KSV為猝滅常數(shù)；τ0為BSA 的平均壽命，10－8s［7］；［Q］為類似物分子濃度。

根據(jù)方程（1）可作Stern－Volmer曲線（圖3）及計算相關參數(shù)，結果見表1。

圖3 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在35 ℃時的熒光猝滅常數(shù)曲線Fig.3 Stern－Volmer curves of fluorescence quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

表1 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在35 ℃時的Stern－Volmer猝滅常數(shù)Tab.1 Stern－Volmer quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

由表1可知，系列類似物－BSA 作用體系的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq均大于2.0×1010L·mol－1·s－1，動態(tài)猝滅中各種猝滅劑和生物分子的最大分散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，由此可判定類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用體系的猝滅機理為靜態(tài)猝滅，故可以忽略在研究的濃度范圍內(nèi)類似物－BSA 產(chǎn)生的動態(tài)碰撞。

2.3 結合常數(shù)、結合位點數(shù)的計算

根據(jù)文獻［9］，對于靜態(tài)猝滅，熒光猝滅強度與藥物濃度之間的關系可根據(jù)校正過的Stern－Volmer方程表示：

式中：Kb為結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)。

根據(jù)雙對數(shù)回歸曲線方程（2）可求出Kb值、n值及相應的R2值，結果見表2。

表2 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在不同溫度下的結合常數(shù)和結合位點Tab.2 Binding constants and binding sites of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at different temperatures

由表2可知，系列類似物與BSA 均存在一定的結合作用，且結合位點約為1，即類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與BSA 相互作用形成1∶1的復合物。

2.4 結合模式的確定

小分子化合物與生物大分子之間的結合力包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力，結合作用模式主要由熱力學參數(shù)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）反映。從熱力學角度看，ΔH＞0 和ΔS＞0 主要為疏水作用力，ΔH＜0和ΔS＜0反映范德華力或氫鍵的形成，而ΔH≈0和ΔS＞0 表明靜電相互作用［10－11］。熱力學參數(shù)ΔH、ΔS及自由能變ΔG可根據(jù)式（3）、（4）計算［12］：

式中：K為相應溫度下的結合常數(shù)；R 為氣體常數(shù)。計算得到類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 作用體系的熱力學參數(shù)見表3。

表3 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的熱力學參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由表3可知，ΔG均為負值，可知系列類似物與BSA 的結合反應均為自發(fā)過程。類似物Ⅳ－BSA 結合反應的ΔH、ΔS均為負值，表明類似物Ⅳ－BSA 結合作用力主要為氫鍵和范德華力，而類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA結合反應的ΔH、ΔS均為正值，表明疏水作用力是類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA 結合反應的主要作用力。

2.5 同步熒光光譜

同步熒光光譜反映了不同發(fā)色團的性質，當發(fā)射和激發(fā)波長差設定為Δλ＝60nm 時，同步熒光光譜反映色氨酸殘基（Trp residues）的特征信息；當Δλ＝15 nm 時，則反映酪氨酸殘基（Tyr residues）的特征信息［13－14］。系列類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用在25 ℃時的同步熒光光譜見圖4。

圖4 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由圖4可知，隨著類似物的加入，同步熒光強度急劇下降，且均沒有發(fā)生藍移或者紅移，表明系列類似物對BSA 色氨酸殘基及酪氨酸殘基微環(huán)境幾乎沒有影響。

類似物－BSA 結合反應過程中發(fā)生了能量的轉換，即有部分能量轉換為非輻射能（熒光猝滅），能量轉換的多少反映藥物與蛋白結合作用的強弱，能量轉換越大表明結合作用越強，結合反應生成的復合物就越穩(wěn)定。在同步熒光檢測中，能量轉換效率（熒光猝滅效率）可用方程（5）計算［15］：

式中：F0和F為BSA 溶液的熒光強度和逐步加入類似物時的同步熒光強度。以RSFQ對類似物濃度［Q］作圖（圖5），可看出類似物Ⅲ在△λ＝15nm 和△λ＝60nm 時的熒光能量轉換率都非常低，表明類似物Ⅲ與BSA 的酪氨酸殘基及色氨酸殘基的結合作用不強，可以判斷類似物Ⅲ可能存在著與BSA 上其它殘基的結合位點。同時還可以看出類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在△λ＝15nm 時的能量轉移比在△λ＝60nm 時的能量轉移低，可判斷類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于與BSA 分子的的色氨酸殘基結合。4種藥物與BSA 在酪氨酸殘基和色氨酸殘基兩個結合位點結合作用強弱順序為：Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ。

圖5 類似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的同步熒光猝滅率Fig.5 Ratios of synchronous fluorescence quenching of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

3 結論

在pH＝7.4、離子濃度為0.1 mol·L－1的條件下，對以水楊酸和磺胺為原料合成的4個新化合物水楊酸磺胺類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進行光譜分析，研究其與BSA 的相互作用。4個新化合物對BSA 的熒光猝滅機理均為靜態(tài)猝滅，結合位點數(shù)約為1，形成1∶1的復合物。類似物Ⅳ與BSA 結合反應的作用力主要為氫鍵和范德華力，而疏水作用力是類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA結合反應的主要作用力。通過熱力學常數(shù)計算，可知系列類似物與BSA 的結合反應是自發(fā)過程。同步熒光光譜顯示，系列類似物對BSA 色氨酸殘基及酪氨酸殘基微環(huán)境幾乎沒有影響。通過對同步熒光猝滅的能量轉換效率計算，可以判斷類似物Ⅲ可能存在著與BSA 上其它殘基的結合位點，同時類似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于與BSA 分子的色氨酸殘基結合。

（致謝：本研究受到廣西大型儀器協(xié)作公用網(wǎng)、廣西中醫(yī)藥研究院廣西中藥質量標準研究重點實驗室資助。）

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