水溶性丁二酸酐酰化殼聚糖納米凝膠的制備及其pH響應(yīng)性研究

（青島科技大學(xué)橡塑材料與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省橡塑材料與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266042）

納米粒子凝膠化［1－3］是近年來的研究熱點(diǎn)，它既具有納米粒子的表面效應(yīng)（surface effect）和小尺寸效應(yīng)（small size effect），又具備凝膠所特有的溶脹收縮性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于藥物釋放等領(lǐng)域。

殼聚糖是甲殼素N－脫乙?；漠a(chǎn)物，化學(xué)名稱為（1，4）－2－氨基－2－脫氧－β－D－葡萄糖，是一種資源豐富、價(jià)格低廉的天然高分子，它具有良好的生物相容性［4－5］、生物可降解性［6］及抗腫瘤免疫增強(qiáng)作用［7－8］，在生物醫(yī)藥［9－10］、食品化工、廢水處理［11］等領(lǐng)域得到了廣泛研究和應(yīng)用。但殼聚糖溶解性較差，需要通過物理或化學(xué)改性［12－13］改善它的溶解性以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。丁二酸酐?；瘹ぞ厶鞘且环N水溶性的殼聚糖衍生物，由殼聚糖與丁二酸酐發(fā)生?；磻?yīng)得到。殼聚糖的?；磻?yīng)降低了殼聚糖分子內(nèi)和分子間形成氫鍵的能力，破壞了殼聚糖分子鏈原有的規(guī)整性，導(dǎo)致其結(jié)晶性明顯降低，使得丁二酸酐?；瘹ぞ厶堑乃苄源蟠筇岣?，改善了殼聚糖成型加工性并擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

作者在室溫下先制備了丁二酸酐?；瘹ぞ厶?，通過元素分析探討反應(yīng)物料比對(duì)產(chǎn)物?；〈燃八苄缘挠绊?，然后將丁二酸酐酰化殼聚糖加入到甲酸溶液中通過自組裝得到納米凝膠粒子，通過掃描電子顯微鏡對(duì)粒子的形態(tài)進(jìn)行表征與分析，利用粒徑分析儀（DLS）研究粒子的粒徑大小與溶液酸堿度的關(guān)系，擬為后續(xù)藥物控制釋放的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

低分子量殼聚糖（CS，脫乙酰度91%，Mn＝20 000），青島海匯生物工程有限公司；丁二酸酐（SAA），分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水碳酸鈉、氫氧化鈉、冰乙酸、丙酮、鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%）、甲酸等均為分析純。

HC－3018型高速離心機(jī)；PHS－3C 型pH 計(jì)，上海雷磁；Zeta電位分析儀、粒徑分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TENSOR－27型傅立葉紅外光譜儀（KBr壓片）；Vario EL Ⅲ型元素分析儀，德國(guó)；XRD－7000S／L型X－射線衍射儀；JSM－7500F 型掃描電子顯微鏡，日本電子。

1.2 丁二酸酐酰化殼聚糖的制備

稱取2.0g殼聚糖于250 mL 圓底燒瓶中，加入150mL 蒸餾水，室溫磁力攪拌30 min，使充分溶脹；按比例稱取2.0g 無水碳酸鈉和丁二酸酐，將二者混合均勻后均分為4份；每隔30min向圓底燒瓶中加入1份，加完后反應(yīng)3h；用1mol·L－1的氫氧化鈉溶液調(diào)反應(yīng)液pH 值至10，離心；取上清液（沉淀物為未反應(yīng)的殼聚糖），用冰乙酸調(diào)pH 值至3，得到大量銀耳狀凝膠物質(zhì)，過濾，干燥，即得丁二酸酐酰化殼聚糖。

1.3 丁二酸酐?；瘹ぞ厶羌{米凝膠粒子的制備

取制得的丁二酸酐酰化殼聚糖0.2g溶于50mL蒸餾水中，常溫下攪拌使充分溶解；用注射器取0.5 mL緩慢滴入0.5mL的甲酸溶液中，溶液逐漸呈藍(lán)色乳光液，常溫下?lián)]發(fā)溶劑，真空干燥，即得自組裝的丁二酸酐?；瘹ぞ厶羌{米凝膠粒子。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)物料比對(duì)產(chǎn)物?；〈群退苄缘挠绊懀ū?）

表1 反應(yīng)物料比對(duì)產(chǎn)物酰化取代度和水溶性的影響Tab.1 The effect of material ratio on acylated substitution degree and water－solubility

由表1可以看出：（1）當(dāng)丁二酸酐與殼聚糖物質(zhì)的量比為1.5時(shí)，C／N 值較小，?；潭容^低，被取代的氨基數(shù)較少，氫鍵作用仍然很強(qiáng)，水溶性較差；而當(dāng)物質(zhì)的量比大于1.5時(shí)，隨丁二酸酐加入量的增加，C／N值有較大提高，水溶性增強(qiáng)。綜合考慮，丁二酸酐與殼聚糖物質(zhì)的量比以2.0 為最佳，此時(shí)C／N 值最大。（2）隨著碳酸鈉與丁二酸酐物質(zhì)的量比的增大，產(chǎn)物的C／N 值逐漸增大，?；〈戎饾u增大；當(dāng)物質(zhì)的量比為0.80時(shí)，C／N 值達(dá)到最大，產(chǎn)物的?；〈容^高且溶解性較好。因此，碳酸鈉與丁二酸酐物質(zhì)的量比以0.80為最佳。

2.2 FTIR分析（圖1）

圖1 殼聚糖（a）與丁二酸酐?；瘹ぞ厶牵╞）的紅外光譜Fig.1 FTIR Spectra of chitosan（a）and succinyl chitosan（b）

由圖1可以看出：3 441cm－1處是?；瘹ぞ厶侵校璑H2和－OH 的多重吸收峰；3 200～2 500cm－1處的吸收峰與殼聚糖相比，峰寬而散，說明－COOH 的存在；1 654cm－1處的寬峰為羧酸C＝O 的特征峰；1 565cm－1處為酰胺中N－H 的彎曲振動(dòng)峰；1 412 cm－1、1 070cm－1處是酰胺中C－N 的伸縮振動(dòng)峰；900cm－1處是羧基中O－H 的面外彎曲振動(dòng)峰。以上特征峰均顯示丁二酸酐與殼聚糖發(fā)生了?；磻?yīng)，且?；磻?yīng)基本發(fā)生在氨基上。

2.3 XRD分析（圖2）

圖2 殼聚糖（a）和丁二酸酐?；瘹ぞ厶牵╞、c）的XRD圖譜Fig.2 XRD Patterns of chitosan（a）and succinyl chitosan（b，c）

由圖2可知：（1）殼聚糖（a曲線）在2θ＝10°、20°處有2個(gè)強(qiáng)衍射峰，這是殼聚糖分子結(jié)晶化程度的體現(xiàn)，是殼聚糖的特征衍射峰。（2）丁二酸酐酰化殼聚糖（b、c曲線）在2θ＝10°處的衍射峰消失，在2θ＝20°處的衍射峰強(qiáng)度減弱，說明丁二酸酐酰化反應(yīng)一定程度上破壞了殼聚糖分子鏈原有的規(guī)整性，降低了殼聚糖分子內(nèi)和分子間形成氫鍵的能力，結(jié)晶性明顯降低；在2θ＝25°～30°之間出現(xiàn)了新的衍射峰，說明丁二酸酐與殼聚糖反應(yīng)后在產(chǎn)物中形成了一種不同于殼聚糖的新的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成可能與丁二酸酐?；瘹ぞ厶堑膫?cè)鏈－NHCOCH2CH2COOH 的規(guī)整排列有關(guān)，且很明顯地看到，當(dāng)丁二酸酐與殼聚糖物質(zhì)的量比為2.0時(shí)，2θ＝20°處的衍射峰強(qiáng)度大大減弱（c曲線），氫鍵的作用力明顯減小，結(jié)晶性能大幅降低，水溶性相應(yīng)增強(qiáng)。

2.4 粒徑分布及Zeta電位分析（圖3）

圖3 丁二酸酐?；瘹ぞ厶堑钠骄胶蚙eta電位隨溶液pH 值的變化Fig.3 Changes of average particle size and Zeta potential of succinyl chitosan with pH value of solution

由圖3可以看出：存在一個(gè)等電點(diǎn)pI＝3.54。當(dāng)pH＜3.54時(shí)，平均粒徑隨pH 值的減小先減小后增大，當(dāng)pH＝3.23時(shí)達(dá)到極小值。因?yàn)樵谒嵝詶l件下，丁二酸酐酰化殼聚糖分子鏈通過氫鍵締合而收縮使微粒平均粒徑減小，但pH 值逐漸減小而使氫鍵作用力逐漸增大并相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且pH 值小于pI值時(shí)粒子質(zhì)子化帶正電相互排斥，導(dǎo)致微粒平均粒徑隨著pH 值的減小逐漸增大；當(dāng)pH＝3.54時(shí)，溶液中的正負(fù)電荷達(dá)到平衡，靜電作用消失，丁二酸酐酰化殼聚糖溶解度變小開始析出；當(dāng)pH＞3.54時(shí)，溶液中正負(fù)電荷重新出現(xiàn)，由于丁二酸酐?；瘹ぞ厶堑聂然饾u去離子化為－COO－帶負(fù)電，當(dāng)pH 值逐漸增大且當(dāng)pH＞3.82時(shí)電荷濃度逐漸增加，電荷之間的排斥作用隨之增大，導(dǎo)致微粒平均粒徑也逐漸變大。表明丁二酸酐酰化殼聚糖具有pH 響應(yīng)性，可以作為智能型藥物載體材料。

2.5 納米凝膠粒子的粒徑分布（圖4）

圖4 丁二酸酐酰化殼聚糖納米凝膠粒子在不同pH 值下的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of succinyl chitosan nanogel particles at different pH values

由圖4可以看出：納米凝膠粒子在加堿前（酸性條件下）平均粒徑為70～80nm；加堿后（堿性條件下）粒徑明顯增大，平均粒徑為350～700nm。說明制得的納米凝膠粒子在酸性條件下是收縮的，而在堿性條件下是溶脹的。表明該納米凝膠粒子具有pH 響應(yīng)性，可用于智能型藥物緩釋載體的制備，載藥后可以實(shí)現(xiàn)在酸性條件下不釋放、在堿性條件下釋放的目的。

2.6 納米凝膠粒子的SEM 分析（圖5）

圖5 丁二酸酐?；瘹ぞ厶羌{米凝膠粒子的SEM 照片（×50000）Fig.5 SEM Images of succinyl chitosannanogel particles（×50000）

由圖5可以看出：自組裝法制備的丁二酸酐酰化殼聚糖納米凝膠粒子呈球形，且大小均一、分散性好，粒徑約為20～30nm。

3 結(jié)論

以水為介質(zhì)、碳酸鈉為催化劑，成功合成了丁二酸酐?；瘹ぞ厶恰＜t外光譜分析表明，?；磻?yīng)基本發(fā)生在殼聚糖C－2位氨基上；元素分析表明，當(dāng)丁二酸酐與殼聚糖物質(zhì)的量比為2.0且碳酸鈉與丁二酸酐物質(zhì)的量比為0.80時(shí)，?；a(chǎn)物的C／N 值最大即在殼聚糖上接枝的丁二酸酐的量最多，產(chǎn)物水溶性最好；酰化反應(yīng)破壞了殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵相互作用，結(jié)晶性明顯降低；Zeta電位分析發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)等電點(diǎn)pI＝3.54。SEM 照片顯示采用自組裝法制備的丁二酸酐?；瘹ぞ厶羌{米凝膠粒子大小均一、分散性好，粒徑為20～30nm；DLS表明納米凝膠粒子在酸性條件下是收縮的，平均粒徑為70～80nm，而在堿性條件下是溶脹的，平均粒徑為350～700nm。綜合分析發(fā)現(xiàn)丁二酸酐酰化殼聚糖納米凝膠粒子具有pH 響應(yīng)性，可以廣泛應(yīng)用于智能型藥物載體的制備，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域藥物控制釋放的研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］GU Z，DANG T T，MA M L，et al.Glucose－responsive microgels integrated with enzyme nanocapsules for closed－loop insulin delivery［J］.ACS Nano，2013，7（8）：6758－6766.

［2］GU Z，AIMETTI A A，WANG Q，et al.Injectable nano－network for glucose－mediated insulin delivery［J］.ACS Nano，2013，7（5）：4194－4201.

［3］CHEN D，SONG P，JIANG F，et al.pH－Responsive mechanism of a deoxycholic acid and folate comodified chitosan micelle under cancerous environment［J］.Journal of Physical Chemistry B，2013，117（5）：1261－1268.

［4］SHI B Y，SHEN Z Y，ZHANG H，et al.ExploringN－imidazolyl－O－carboxymethyl chitosan for high performance gene delivery［J］.Biomacromolecules，2012，13（1）：146－153.

［5］LIU T Y，CHEN S Y，LIN Y L，et al.Synthesis and characterization of amphiphatic carboxymethyl－h(huán)exanoyl chitosan hydrogel：Water－retention ability and drug encapsulation［J］.Langmuir，2006，22（23）：9740－9745.

［6］DONG W，HAN B Q，F(xiàn)ENG Y L，et al.Pharmacokinetics and biodegradation mechanisms of a versatile carboxymethyl derivative of chitosan in rats：Invivoandinvitroevaluation［J］.Biomacromolecules，2010，11（6）：1527－1533.

［7］NAM T，PARK S，LEE S Y，et al.Tumor targeting chitosan nanoparticles for dual－modality optical／MR cancer imaging［J］.Bioconjugate Chemistry，2010，21（4）：578－582.

［8］Lü P P，MA Y F，YU R，et al.Targeted delivery of insoluble cargo（paclitaxel）by PEGylated chitosan nanoparticles grafted with Arg－Gly－Asp（RGD）［J］.Molecular Pharmaceutics，2012，9（6）：1736－1747.

［9］AMOOZGAR Z，PARK J，LIN Q，et al.Low molecular－weight chitosan as a pH－sensitive stealth coating for tumor－specific drug delivery［J］.Molecular Pharmaceutics，2012，9（5）：1262－1270.

［10］SUNG H W，SONAJE K，LIAO Z X，et al.pH－Responsive nanoparticles shelled with chitosan for oral delivery of insulin：From mechanism to therapeutic applications［J］.Accounts of Chemical Research，2012，45（4）：619－629.

［11］wan NGAH W S，LIANG K H.Adsorption of gold（Ⅲ）ions onto chitosan andN－carboxymethyl chitosan：Equilibrium studies［J］.Industrial ＆ Engineering Chemistry Research，1999，38（4）：1411－1414.

［12］WANG J，CHEN J S，ZONG J Y，et al.Calcium carbonate／carboxymethyl chitosan hybrid microspheres and nanospheres for drug delivery［J］.Journal of Physical Chemistry C，2010，114（44）：18940－18945.

［13］LAUDENSLAGER M J，SCHIFFMAN J D，SCHAUER C L.Carboxymethyl chitosan as a matrix material for platinum，gold，and silver nanoparticles［J］.Biomacromolecules，2008，9（10）：2682－2685.