銅綠假單胞菌norB基因的克隆及表達

（福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州350002）

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，活性氮污染日益突出，嚴重影響人們的日常生活。活性氮滲透范圍較廣，不僅包括人們所熟知的水體中的NO－3－N、NO－2－N 和NH＋4－N，而且包括大氣中的氮氧化物（NOx），如NO、N2O、N2O3等。我國排放的NOx主要來源于燃煤，以NO為主，約占95%以上。

目前，各國對活性氮污染的治理進行了深入研究，生物脫氮由于成本低及二次污染小而備受關注，已開發(fā)出諸多脫氮工藝，如同步硝化反硝化［1］、序批式反應器［2］、全程自養(yǎng)脫氮［3］、厭氧氨氧化［4］、高活性氨氮去除反應器［5］等，但處理的對象主要是水體中的活性氮，對大氣中NOx的生物脫氮工藝研究相對薄弱。生物過濾系統(tǒng)［6－11］是針對NOx的生物脫氮工藝，目前還在實驗室模擬階段，尚未有工業(yè)化應用的實例，其原因主要有兩點：（1）大氣中的NOx以氣體形式存在，要進行生物脫氮必先經(jīng)過吸附、溶解等過程，但NOx的溶解性較差，尤其是NO 幾乎不溶于水；（2）生物過濾系統(tǒng)中形成的生物膜成分復雜且受環(huán)境影響較大，因而隨著外部環(huán)境的變化，生物膜的微生物種類及其活性也發(fā)生變化，導致NOx去除效率波動較大。

活性氮的去除主要是通過細菌的反硝化作用，即在相關還原酶的作用下，把NO－3最終還原成N2：NO－3→NO－2→NO→N2O→N2。NO 作為中間代謝產(chǎn)物，對細胞具有很大毒性，不會在細胞中積累，產(chǎn)生后會被迅速還原。而此過程由對NO 具有很高親和力的一氧化氮還原酶（Nor）完成，它催化2分子NO 形成1分子N2O［12］?？紤]到NO 的處理難度，為提高NO 的可溶性，作者在此將目的基因norB克隆至表達載體并構建基因工程菌，使之有效表達Nor催化亞單位NorB，提高對NO 的捕獲能力，從而提高NOx的去除效率。

1 實驗

1.1 材料

銅綠假單胞菌B136－33，華南理工大學亢春喜博士惠贈；克隆菌DH5α、表達菌BL21、質(zhì)粒pET－28a，自行保存；PCR 及相關酶切試劑，TaKaRa公司；基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；SDS－PAGE相關試劑，Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

利用軟件Primer premier 5.0，根據(jù)GenBank 公布的銅綠假單胞菌B136－33norB基因序列及pET－28a上的多克隆位點設計引物。上游引物：5′－CG－GAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC－3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；下游引物：5′－CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）。上海生工生物工程有限公司負責引物合成。

1.2.2norB基因的擴增

以試劑盒提取的基因組DNA 為模板擴增norB片段。PCR 程序：94 ℃預變性5min；94 ℃變性45s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸90s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳后，分析PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 質(zhì)粒pET－28a－norB及表達菌株BL21－pET－28anorB的構建

將質(zhì)粒pET－28a及回收的norB基因片段進行雙酶切（EcoRⅠ、HindⅢ），T4DNA 連接酶連接構建質(zhì)粒pET－28a－norB，化學轉(zhuǎn)化至克隆菌DH5α，以卡那霉素抗性平板篩選成功的轉(zhuǎn)化子。然后將轉(zhuǎn)化子接至含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，逐步經(jīng)過菌液PCR、質(zhì)粒PCR、雙酶切及測序等鑒定程序，再把測序正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒pET－28a－norB化學轉(zhuǎn)化至表達菌BL21，以卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化成功的BL21－pET－28a－norB，挑選單菌落，37 ℃培養(yǎng)12h后，菌種加入15%的甘油于－80 ℃保存。

1.2.4 目的蛋白分子量的鑒定

將BL21－pET－28a－norB在LB 液體培養(yǎng)基中以250r·min－1、37 ℃培養(yǎng)約3h，至A600約為1.0時加入IPTG 誘導norB的表達。IPTG 誘導濃度為0.5 mmol·L－1、1mmol·L－1，誘導時間1.5h，誘導溫度37 ℃。對誘導后的菌液處理后，進行SDS－PAGE（電壓100V，30min；電壓120V，3h）電泳，考馬斯亮藍染色，脫色后分析目的蛋白質(zhì)的分子量。

1.2.5 葡萄糖對norB基因表達的影響

為抑制本底表達，在LB液體培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖，按1.2.4方法進行SDS－PAGE電泳。

2 結果與討論

2.1 norB 基因的擴增

norB基因的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1a。

圖1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由圖1a可知，目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中的位置與GenBank公布的norB基因大小（1 401bp）基本相符。

2.2 重組質(zhì)粒pET－28a－norB 的構建及鑒定

從卡那霉素抗性平板上隨機挑選出10株陽性克隆菌DH5α－pET－28a－norB，接至LB 液體培養(yǎng)基增菌后，依次進行菌液PCR（圖1b）、質(zhì)粒PCR（圖1c），結果發(fā)現(xiàn)，只有菌株7 為陽性克隆菌DH5α－pET－28anorB（圖1b）。對菌株7中的重組質(zhì)粒進行雙酶切后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖1d），結果與預期完全相符（共2 個片段，大片段約5 300bp，小片段約1 400 bp）。隨后，對重組質(zhì)粒測序，并通過BLAST 分析，結果見圖2。

圖2中灰色背景序列分別為酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ，波浪線序列分別為起始密碼子和終止密碼子，2個密碼子之間即為目的片段norB基因的序列，與GenBank公布序列一致，說明重組質(zhì)粒pET－28anorB構建成功。

2.3 目的蛋白NorB分子量的鑒定

按norB基因的氨基酸序列推測，目的蛋白NorB的理論分子量約為52kDa，然而，眾多研究結果表明，NorB在SDS－PAGE 中的表觀分子量約為37～38 kDa，而由圖3可知，目的蛋白（箭頭所示）的遷移位置在40kDa附近，與NorB的表觀分子量基本相符。

圖2 重組質(zhì)粒pET－28a－norB 測序結果Fig.2 Sequence of recombinant plasmid pET－28a－norB

圖3 NorB的SDS－PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB

2.4 葡萄糖對norB 表達的影響

由于未加入IPTG 的重組質(zhì)粒亦表達了NorB（圖3條帶1），推測可能存在本底表達現(xiàn)象。為驗證此現(xiàn)象，在LB液體培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖，再誘導表達，進行SDS－PAGE分析，結果見圖4。

由圖4可看出，葡萄糖的加入抑制了本底表達，即加入IPTG 后，在40kDa附近出現(xiàn)了目的蛋白。

2.5 討論

（1）大氣中NOx的治理是一個技術難題，其中一個重要原因就是NO 難溶于水。為提高去除效率，增大NO 可溶性就成為了一種必要手段，如Fe（Ⅱ）－EDTA 對NO 具有很好的吸收能力，但Fe（Ⅱ）－EDTA 易被氧化成Fe（Ⅲ）－EDTA，從而不能結合NO［13］，致使NO 去除率下降。為再生Fe（Ⅱ）－EDTA，Li等［14］在系統(tǒng)中加入了大腸桿菌FR－2（鐵還原細菌），并深入研究了Fe（Ⅱ）－EDTA 對Fe（Ⅲ）－EDTA 生物還原的影響。此外，從生物學角度，NO 的去除要依靠Nor的作用，Nor對NO 具有非常高的親和力，能迅速“捕捉”NO，本實驗通過PCR 擴增、基因克隆、表達載體構建等，有效地表達出了Nor催化亞單位NorB，為提高NO 的去除效率奠定了理論基礎。

圖4 加入1%葡萄糖后的NorB的SDS－PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB supplemented with 1%glucose

（2）細菌Nor為膜結合蛋白，含有2 個亞單位，NorC和NorB，分別由基因norC和norB編碼。NorC分子量相對較小，為膜結合細胞色素c；NorB 分子量相對較大，為催化部位，由12 條跨膜α－螺旋構成［15］，具有極強的疏水性，對表達極為不利。本實驗也證實，與其它生物脫氮中的還原酶（如亞硝酸還原酶［16］）的表達量相比，NorB 的表達量較低（圖3、4）。然而，考慮到Nor對NO 的極高親和力，即使NorB 的表達量不高，也仍然對NO 的去除具有積極的意義。

3 結論

為使norB基因得到有效表達，利用分子生物學技術將銅綠假單胞菌B136－33的norB基因克隆至表達載體pET－28a 上，并構建基因工程菌，高效表達NorB，提高對NO 的捕獲能力，從而提高NOx的去除效率。

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