色串孢屬真菌Torulasp.YMF1.03791的化學(xué)成分研究

（云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091）

色串孢屬真菌屬于半知菌綱、叢梗孢目（Moniliales）、暗梗孢科（Dematiaceae）、色串孢屬（Torula）［1］。有關(guān)此屬真菌的次生代謝產(chǎn)物研究主要是真菌Torulaherbarum。Kadkol等［1－2］從該真菌中分離到萘醌類(lèi)化合物dehydroherbarin和herbarin，具有弱的抗細(xì)菌和真菌活性及抗阿米巴活性。Narasimhachari等［3］從該真菌中分離到化合物o－methylherbarin。耿婉麗［4］從海參共附生真菌T.herbarum中分離鑒定了15 個(gè)化合物，其中萘醌類(lèi)化合物10 個(gè)、環(huán)二肽1 個(gè)、多羥基甾醇4 個(gè)，并對(duì)這些化合物進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)化合物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63、肺癌細(xì)胞A549、結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo均有一定的抑制活性。為此，作者對(duì)該屬真菌Torulasp.YMF1.03791進(jìn)行化學(xué)成分研究，并對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤、抑菌、殺線蟲(chóng)活性測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

柱層析凝膠Sephadex LH－20，Pharmacia；柱層析硅膠（200～300目）、硅膠G 板，青島海洋化工廠。

所用有機(jī)溶劑均為重蒸工業(yè)純?cè)噭?/p>

Bruker DRX－500 型超導(dǎo)核磁共振儀；Finnigan LCQ－Advantage型質(zhì)譜儀。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

菌株Torulasp.YMF1.03791，保存于云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1 000mL，pH 值自然。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL，pH 值自然。

1.3 Torulasp.YMF1.03791次生代謝產(chǎn)物的分離

1.3.1 菌株的擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)

首先挑取菌塊（1cm×1cm）于PDA 培養(yǎng)基上活化，在28℃恒溫條件下培養(yǎng)10d；再挑取菌塊（1cm×1cm，3塊·瓶－1）于裝有100mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中活化（28 ℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)）10d；然后按5%的接種量接種于裝有250mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶（500mL）中，共10L，于28 ℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)20d。

1.3.2 菌株代謝產(chǎn)物的分離

將上述培養(yǎng)物過(guò)濾，分開(kāi)菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液減壓濃縮至1L 左右，將濃縮液用乙酸乙酯萃取3次，濃縮合并后得到粗提物0.86g。粗提物過(guò)甲醇凝膠，得到7個(gè)粗組分（A1～A7）。組分A4（108mg）過(guò)甲醇凝膠，得到3 個(gè)組分（A4－1～A4－3）。A4－2（47 mg）用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干后過(guò)正相柱，石油醚裝柱，用石油醚－丙酮（20∶1）洗脫，得到化合物Ⅰ（6 mg）。

將菌絲體用甲醇浸泡，浸泡液減壓濃縮后得到2.05g粗提物。粗提物過(guò)甲醇凝膠，得到5個(gè)粗組分（B1～B5）。組分B4（247mg）過(guò)甲醇凝膠，得到3個(gè)組分（B4－1～B4－3）。B4－2（77mg）用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干后過(guò)正相柱，石油醚裝柱，用石油醚－乙酸乙酯（40∶1）洗脫，得到3個(gè)組分（B4－2－1～B4－2－3）。B4－2－3（42mg）用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干后過(guò)正相柱，石油醚裝柱，用石油醚－乙酸乙酯（60∶1）洗脫，得到化合物Ⅱ（5mg）。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

分別對(duì)化合物Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，以確定其結(jié)構(gòu)。

1.5 活性測(cè)定

1）抗腫瘤活性：選擇人肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞SK－OA－3作為供試腫瘤細(xì)胞，測(cè)定化合物Ⅰ和Ⅱ的抗腫瘤活性。每個(gè)化合物選擇30μg·mL－1、10μg·mL－1、3μg·mL－1、1μg·mL－1、0.3μg·mL－1、0.1 μg·mL－1等6個(gè)濃度梯度。

2）抑菌活性：將化合物Ⅰ和Ⅱ用甲醇溶解，加到濾紙片（直徑0.6cm）上，使每個(gè)濾紙片上化合物含量分別為200μg、400μg、800μg。病原細(xì)菌培養(yǎng)24h，病原真菌培養(yǎng)1～4d，測(cè)量抑菌圈大小。

3）殺線蟲(chóng)活性：體外測(cè)定殺線蟲(chóng)活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：淡紅色固體。ESI－MS：287［M ＋1］＋。1HNMR（500 MHz，CDCl3），δ：1.99（3H，s），3.93（3H，s，MeO），3.94（3H，s，MeO），5.11（2H，s），5.84（1H，m，H－4），6.70（1H，d，J＝2.4 Hz，H－8），7.22（1H，d，J＝2.4 Hz，H－6）；13CNMR（500 MHz，CDCl3），δ：20.1（q），55.9（MeO），56.5（MeO），63.4（t），93.8（d），103.6（d），104.3（d），114.6（q），124.9（q），135.4（q），135.6（q），161.6（q），163.2（q），164.1（q），180.9（q），182.23（q）。與文獻(xiàn)值［1］相比較，確定化合物Ⅰ為dehydroherbarin（圖1）。

化合物Ⅱ：黃色固體。ESI－MS：284［M ＋1］＋。1HNMR（500 MHz，CD3COCD3），δ：9.23（1H，s），7.79（1H，s），7.35（1H，d，J＝2.5 Hz），7.05（1H，d，J＝2.5Hz），4.02（3H，s），4.01（3H，s），2.87（3H，s）；13CNMR（125 MHz，CD3COCD3），δ：184.9（s），181.1（s），166.9（s），165.7（s），164.9（s），150.7（d），139.4（s），138.8（s），125.4（s），118.7（d），117.1（s），106.7（d），105.8（d），57.8（q），57.5（q），25.8（q）。與文獻(xiàn)值［5］相比較，確定化合物Ⅱ?yàn)閟corpinone（圖1）。

圖1 化合物Ⅰ和Ⅱ的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of compoundⅠandⅡ

2.2 抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）化合物Ⅰ在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞無(wú)抑制活性；在濃度為0.1μg·mL－1、0.3 μg·mL－1、1μg·mL－1時(shí)對(duì)SK－OA－3細(xì)胞均沒(méi)有抑制活性，在濃度為3μg·mL－1時(shí)對(duì)SK－OA－3細(xì)胞的抑制率為16%，在濃度為10μg·mL－1時(shí)的抑制率為65%，在濃度為30μg·mL－1時(shí)的抑制率為93%。（2）化合物Ⅱ在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞和SKOA－3細(xì)胞均沒(méi)有抑制活性。

2.3 抑菌活性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：化合物Ⅰ對(duì)大腸桿菌（Escherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）有弱的抑制活性，在800μg時(shí)的抑菌圈直徑分別為1.0cm 和1.2 cm；化合物Ⅱ在測(cè)試濃度范圍內(nèi)沒(méi)有抑菌活性。

2.4 殺線蟲(chóng)活性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物Ⅰ和Ⅱ均沒(méi)有殺線蟲(chóng)活性。

3 結(jié)論

從色串孢屬真菌Torulasp.YMF1.03791發(fā)酵液乙酸乙酯提取物以及菌絲的甲醇提取物中分離到2個(gè)化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析鑒定為dehydroherbarin（Ⅰ）和scorpinone（Ⅱ）?；衔铫駥?duì)宮頸癌細(xì)胞SK－OA－3有抑制活性，對(duì)大腸桿菌（E.coli）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）有弱的抑制活性，無(wú)殺線蟲(chóng)活性。化合物Ⅱ無(wú)抗腫瘤活性、抑菌活性和殺線蟲(chóng)活性。

［1］KADKOL M V，GOPALKRISHNAN K S，NARASIMHACHARI N.Isolation and characterization of naphthaquinone pigments fromTorulaherbarum（Pers.）.Herbarin and dehydroherbarin［J］.Journal of Antibiotics，1971，24（4）：245－248.

［2］NAGARAJAN R，NARASIMHACHARI N，KADKOL M V，et al.Structure of herbarin［J］.Journal of Antibiotics，1971，24（4）：249－252.

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［4］耿婉麗.中國(guó)南海五角瓜參共生真菌Torulaherbarum和藍(lán)斑背肛海兔共生真菌Chaetomiumsp.活性成分研究［D］.開(kāi)封：河南大學(xué)，2012.

［5］MILJKOVIC A，MANTLE P G，WILLIAMS D J，et al.Scorpinone：A new natural azaanthraquinone produced by a bispora－like tropical fungus［J］.Journal of Natural Products，2001，64（9）：1251－1253.