黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌對18種抗生素的耐藥性分析

郭嘉紅，王文生，周敬華，閆東輝

(1.河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北大廠065300;2.河北省三河市醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北三河065200; 3.河北省永清縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北永清065600;4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100050)

黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌對18種抗生素的耐藥性分析

郭嘉紅1，王文生2，周敬華3，閆東輝4

(1.河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北大廠065300;2.河北省三河市醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北三河065200; 3.河北省永清縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北永清065600;4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100050)

目的比較黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)在體外藥物敏感性試驗(yàn)中對各種藥物的耐藥性，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。方法 使用生物梅里埃API20NE系統(tǒng)對菌株進(jìn)行鑒定，用K-B紙片法和微量肉湯稀釋法對菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果黏液型PA對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素100.0%敏感，其余抗菌藥物的耐藥率為2.6%～78.3%;非黏液型PA對復(fù)方新諾明100.0%耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率為2.6%～96.6%。除黏菌素、阿米卡星外，黏液型PA耐藥率均顯著低于非黏液型PA(P＜0.05或＜0.01)。結(jié)論黏液型PA的體外耐藥性明顯弱于非黏液型PA，但由于其能產(chǎn)生大量藻酸鹽，而在菌體外形成生物膜，因此要加強(qiáng)非黏液型PA的檢測，指導(dǎo)臨床合理用藥。

銅綠假單胞菌;抗生素類;抗藥性，細(xì)菌

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是非發(fā)酵菌之一，為條件致病菌，廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境，其易定植、易變異以及多重耐藥性的特征，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一［1］。它是院內(nèi)呼吸道感染的首要病因，在重癥監(jiān)護(hù)病房特殊護(hù)理的插管患者中尤為嚴(yán)重，病死率在40%～50%。PA可導(dǎo)致院內(nèi)泌尿道感染、傷口感染、慢性活動(dòng)性腹膜炎透析患者腹膜炎和菌血癥。PA還是兒童和成人艾滋病患者發(fā)病和死亡的重要原因。PA從菌落形態(tài)可分為黏液型和非黏液型。黏液型PA由于大量產(chǎn)生藻酸鹽而在菌體外形成生物被膜，該被膜能使菌體逃逸機(jī)體免疫清除和增強(qiáng)對抗菌藥物的耐藥，一旦感染很難從患者體內(nèi)清除，是造成肺囊性纖維化的重要病原菌［2］。本研究對臨床分離的黏液型PA和非黏液型PA進(jìn)行鑒定及藥敏分析，旨在了解黏液型和非黏液型PA的耐藥特征，以便為臨床更有效、更合理地使用抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2010年9月—2013年9月河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院臨床送檢的各類標(biāo)本分離出的PA 383株，其中黏液型PA 115株，非黏液型PA 268株。同一患者相同部位重復(fù)分離到的相同菌株不作重復(fù)計(jì)數(shù)。

1.2 質(zhì)控菌株 PA ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 試劑 法國梅里埃API20NE鑒定卡，藥物敏感性紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，抗菌藥物粉劑購自SigmaAldrich公司，M-H培養(yǎng)基購自天津金章公司。

1.4 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 標(biāo)本送至微生物實(shí)驗(yàn)室后，按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［3］相應(yīng)要求接種、分離，獲得單個(gè)菌落后，經(jīng)法國梅里埃API20NE鑒定為PA，其菌落形態(tài)在麥康凱培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18～24 h，生長為無色、小露滴樣、邊緣不規(guī)則小菌落，48～72 h長大而融合、黏稠、膠凍樣，用接種環(huán)不易挑起的無金屬光澤、無特殊氣味的菌落為黏液型PA。非黏液型PA菌落呈灰綠色，大小不一，扁平濕潤，邊緣不規(guī)則，呈傘狀伸展，有金屬光澤。采用微量肉湯稀釋法和K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)［4］。用K-B紙片擴(kuò)散法對黏液型PA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)應(yīng)延長孵育時(shí)間至48 h。結(jié)果判定按2010年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用細(xì)菌耐藥監(jiān)測軟件WHONET 5.6進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間耐藥性比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鑒定結(jié)果 268株非黏液型PA中，來自痰標(biāo)本檢出率最高221株(82.5%)，來自膿液及分泌物31株(11.6%)，來自咽拭子8株(3.0%)，來自尿液6株(2.2%)，來自血液2株(0.7%)。115株黏液型PA中，來源于痰液109株(94.8%)，來源于膿液及分泌物4株(3.5%)，來源于其他2株(1.7%)。

2.2 藥敏結(jié)果 268株非黏液型PA對黏菌素、阿米卡星耐藥性較低，分別為2.6%、3.0%，對妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美洛培南、亞胺培南、氨曲南耐藥率為10.1%～52.2%，對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復(fù)方新諾明耐藥率為90.7%～100.0%。115株黏液型PA對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、美洛培南藥率為0.0%。對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、亞胺培南耐藥率也很低為2.6%～10.4%，對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復(fù)方新諾明耐藥率為37.4%～78.3%。除黏菌素、阿米卡星外，非黏液型PA對各種藥物的耐藥率明顯均高于黏液型PA，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01)。見表1。

表1 黏液型與非黏液型PA對18種抗生素耐藥率的比較(株數(shù)，%)

3 討 論

PA是引起彌漫性泛細(xì)支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張并感染的重要病原菌之一［5］。本研究中268株非黏液型PA中，來自痰標(biāo)本221株(82.5%)，115株黏液型PA中，來源于痰液109株(94.8%)，與相關(guān)文獻(xiàn)基本一致［6］。

本研究非黏液型PA對抗生素耐藥性較高，其對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素耐藥性較低分別為2.6%、3.0%、10.1%、11.2%、15.3%、16.8%，與朱荔清等［7］的研究結(jié)果基本一致。黏菌素與細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂發(fā)生作用，增加細(xì)胞的通透性并破壞滲透完整性，引起細(xì)胞內(nèi)成分流失，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。黏菌素僅作用于革蘭陰性桿菌，特別是假單胞菌屬細(xì)菌，治療期間很少出現(xiàn)耐藥性，與其他抗生素?zé)o交叉耐藥。黏菌素與復(fù)方新諾明聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，治療多重耐藥假單胞菌屬引起的感染。黏菌素通常作為嚴(yán)重的、威脅生命的假單胞菌感染或?qū)λ锌股啬退幉≡w引起的革蘭陰性菌感染的后備藥物，氣溶性多黏菌素已成功地治療了肺囊性纖維化或支氣管擴(kuò)張癥患者PA定植或呼吸系統(tǒng)感染。但在臨床應(yīng)用中應(yīng)注意其不能穿透膜進(jìn)入胸水、滑液或腦脊液，以及它的神經(jīng)毒性和腎毒性的不良反應(yīng)。非黏液型PA對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、氨基糖苷類抗生素耐藥性也較低，為3.0%、10.1%、16.8%。氨基糖苷類抗生素的主要特點(diǎn)是它們對需氧革蘭陰性桿菌(包括PA)具有殺菌活性，其通過不可逆結(jié)合到細(xì)菌30s核糖體亞單位，抑制細(xì)菌蛋白合成，在蛋白合成期，氨基糖苷類-細(xì)菌核糖體結(jié)合物形成，使mRNA轉(zhuǎn)移障礙，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雖然慶大霉素和妥布霉素有非常相似的抗菌活性譜，而妥布霉素對PA的抗菌活性更強(qiáng)。慶大霉素和妥布霉素容易被耐藥菌產(chǎn)生的同一種修飾酶滅活，因此容易產(chǎn)生交叉耐藥。阿米卡星對多數(shù)氨基糖苷類修飾酶有抗性，所以常用作慶大霉素和妥布霉素耐藥性流行時(shí)的選擇品種。阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素可作為首選的治療PA感染推薦藥物，但因它們的腎臟毒性、聽力或前庭毒性，臨床應(yīng)用受到了局限。非黏液型PA對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、哌拉西、耐藥率分別為11.2%、15.3%、17.9%，它們也可作為治療PA感染的臨床常用藥物。左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶耐藥率分別為19.4%、22.4%、24.6%，這些抗生素對PA具有較強(qiáng)的抗菌作用，但隨著它們在臨床大量、廣泛的應(yīng)用，其耐藥性也在逐年增加。氨曲南耐藥率為52.2%，它與氨基糖苷類具有體外協(xié)同抗菌作用，作為單環(huán)類抗生素細(xì)菌耐受和接種物效應(yīng)較少見，臨床聯(lián)合用藥效果較好。美洛培南、亞胺培南的耐藥率為22.4%、25.0%，與蔣冬香等［8］的研究結(jié)果相似。碳青酶烯類抗生素是針對革蘭陰性桿菌感染療效較為可靠且穩(wěn)定的藥物。近年來，由于它們廣泛應(yīng)用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性桿菌引起的感染，在抗菌藥物選擇性壓力下，使其對PA的敏感性逐年下降，耐碳青酶烯類抗生素開始出現(xiàn)，并逐年增多。細(xì)菌耐藥性來源于產(chǎn)生了能水解碳青霉烯核的碳青酶烯酶和細(xì)菌細(xì)胞壁孔道蛋白通道的改變。其同廣譜頭孢菌素或超廣譜青霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，亞胺培南可以表現(xiàn)出體外抗拮作用，其結(jié)果是它能誘導(dǎo)Ⅰ組β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。因此，臨床用藥時(shí)避免亞胺培南與上述藥物聯(lián)合應(yīng)用，以免引起PA產(chǎn)生耐藥性。頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復(fù)方新諾明耐藥率為90.7%～100.0%，它們對 PA天然耐藥［9］。因此，要加強(qiáng)細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定工作，及時(shí)找出病原菌，合理應(yīng)用抗生素。

黏液型PA是PA自然存在的一種特殊形式，其在細(xì)菌表面產(chǎn)生大量黏液，主要成分為多糖藻，從而可以持續(xù)定植、形成生物膜。一旦PA形成生物膜，有助于細(xì)菌逃逸抗菌藥物或宿主防御機(jī)制，引起感染持續(xù)存在、抗菌藥物治療效果不明顯等［10］。非黏液型PA在滲透壓較高、氯化鈉較多、磷酸鹽較少等環(huán)境條件下容易轉(zhuǎn)化為黏液型PA［11］。體外藥敏試驗(yàn)中，非黏液型PA對抗菌藥物的耐藥率明顯高于黏液型PA。這主要是因?yàn)轶w外藥敏試驗(yàn)只測試浮游狀態(tài)的細(xì)菌，不能反映生物膜介導(dǎo)的耐藥性，常出現(xiàn)黏液型PA雖然體外藥敏試驗(yàn)敏感，但臨床體內(nèi)用藥大多無效，造成實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床治療效果之間的矛盾［12］。這是因?yàn)榧?xì)菌生物被膜可阻礙營養(yǎng)物質(zhì)透過，細(xì)菌代謝低下，且抗菌藥物不易通過被膜，因而產(chǎn)生耐藥性，即使抗菌藥物濃度達(dá)到很高，仍不能殺滅被膜下的細(xì)菌。細(xì)菌生物被膜還能夠避免細(xì)菌與免疫細(xì)胞及抗體相互作用，抑制吞噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生免疫逃逸，從而使其長期生存。藻酸鹽是黏液型PA形成生物被膜的主要成分。體外研究發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽在黏液型PA生物被膜的形成中發(fā)揮著重要的作用，故除去生物被膜必須設(shè)法減少藻酸鹽的合成。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能起到有效抵抗生物被膜的作用。體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，從而使生物膜內(nèi)部細(xì)菌得以暴露，有利于敏感藥物進(jìn)入生物膜內(nèi)部殺滅細(xì)菌。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可使體內(nèi)藻酸鹽免疫復(fù)合物逐漸下降，有效地抑制由藻酸鹽介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng);大環(huán)內(nèi)酯類抗生素尚有免疫調(diào)節(jié)作用，能有效地增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對PA生物膜的吞噬作用［13］。本研究顯示，黏液型PA體外敏感的抗菌藥物較多，除黏菌素、阿米卡星(P＞0.05)外，對其他藥物的耐藥性明顯低于非黏液型PA，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或＜0.05)。黏菌素、阿米卡星對黏液型和非黏液型PA的耐藥性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)且耐藥性較低，可以作為臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥的首選藥物。妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美洛培南、亞胺培南對黏液型PA耐藥率也很低，與非黏液型PA的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在治療黏液型PA引起感染時(shí)，還必須考慮其存在生物被膜耐藥的因素，在臨床使用中應(yīng)與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素聯(lián)合應(yīng)用從而達(dá)到殺菌的目的。在肺囊性纖維化患者肺部感染的晚期，PA可能表現(xiàn)出對所有的抗生素耐藥，大劑量的妥布霉素霧化治療可能有效。體外藥敏試驗(yàn)有13.9%～17.4%的黏液型PA株對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復(fù)方新諾明敏感，可能與這些菌株的基因發(fā)生了突變，也可能與在體外試驗(yàn)中由于黏液型PA的菌落表面覆蓋一層厚厚的黏液，致使制作菌液的過程中挑取了大量的黏液而導(dǎo)致實(shí)際的菌液濃度偏低有關(guān)。但由于PA對上述藥物天然耐藥，因此在治療時(shí)應(yīng)首先排除此類藥物。

總之，通過對黏液型和非黏液型PA耐藥性的分析，了解它們的耐藥特點(diǎn)，可指導(dǎo)臨床正確選擇合理的抗生素進(jìn)行治療，防止耐藥菌的產(chǎn)生。

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(本文編輯:許卓文)

R378.991

B

1007-3205(2015)02-0217-04

2014-05-26;

2014-07-13

郭嘉紅(1971-)，男，河北大廠人，河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院副主任檢驗(yàn)師，從事臨床微生物檢驗(yàn)學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.036