DIAPH-3 蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后的研究

田志輝，王　丹，曹彥坤，馬　力，朱　龍，劉月平*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院CT室，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，河北省乳腺疾病診治中心，河北 石家莊 050011；5.河北省安國市醫(yī)院CT/MRI室，河北 安國 071200)

DIAPH-3 蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后的研究

田志輝1，王丹2，曹彥坤3，馬力4，朱龍5，劉月平2*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院CT室，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，河北省乳腺疾病診治中心，河北 石家莊 050011；5.河北省安國市醫(yī)院CT/MRI室，河北 安國 071200)

[摘要]目的檢測DIAPH-3蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法采用RT-PCR及Western Blot法檢測27例浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織中的DIAPH-3 mRNA及蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)SP法檢測100例浸潤性乳腺癌患者中DIAPH-3的蛋白表達(dá)，分析患者的臨床病理資料，電話隨訪并計(jì)算患者的生存時(shí)間。分析DIAPH-3蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果在浸潤性乳腺癌組織中DIAPH-3蛋白及mRNA的表達(dá)量低于乳腺癌旁組織(P<0.01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)多、脈管有瘤栓、神經(jīng)受侵患者DIAPH-3的表達(dá)陽性率低(P<0.01)；Kaplan-Meier生存分析生存分析顯示，DIAPH-3低表達(dá)的患者5年生存率較低。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析顯示，DIAPH-3蛋白表達(dá)率低是浸潤性乳腺癌患者生存時(shí)間的影響因素(P<0.05)。結(jié)論DIAPH-3與浸潤性乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，可作為評(píng)價(jià)浸潤性乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]乳腺腫瘤；基因；DIAPH-3；預(yù)后

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.013

浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多方面促成、多階段的連續(xù)過程。研究表明，在腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中，DIAPH-3 蛋白起著極其重要的作用，且與靶向藥物抗藥性密切相關(guān)。本研究檢測DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)，探討其與浸潤性乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源收集2013 年10—12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院手術(shù)切除原發(fā)性浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織樣本27 例，患者均為女性，年齡28～71 歲，中位年齡55歲。另收集同醫(yī)院2008年手術(shù)切除原發(fā)性浸潤性乳腺癌標(biāo)本100例，隨訪資料完整，患者均為女性，年齡20～88歲，中位年齡51歲。所有患者術(shù)前均未接受過放化療和內(nèi)分泌治療，生存時(shí)間為34～59個(gè)月，中位生存時(shí)間54個(gè)月，結(jié)果均經(jīng)病理診斷證實(shí)。同時(shí)收集同期手術(shù)切除乳腺纖維腺瘤標(biāo)本22例作為對(duì)照組，患者均為女性，年齡22～78歲，中位年齡48歲。3組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑兔抗人DIAPH-3多克隆抗體購自Proteintech生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Thermo公司。DIAPH-3引物、RNA提取試劑購自上海生工生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國Promega公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR法檢測Trizol一步法提取總RNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)檢測總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。DIAPH-3反應(yīng)體系：取1 μL cDNA產(chǎn)物按照PCR擴(kuò)增試劑盒要求擴(kuò)增。DIAPH-3引物序列，Sense Primer：5′-AGACCTCCACTTCCCAACCT-3′，Anti Sense Primer：5′-CTCACAGGATTGCTGGTCAA-3′，產(chǎn)物長度368 bp。GADPH引物序列，Sense Primer：5′-CTCAGACACCATGGGGAAGCTGA-3′,Anti Sense Primer：5′-ATGAGCTTGAGGCTGTTGT-CATA-3′，產(chǎn)物長度450 bp。反應(yīng)條件為DIAPH-3：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；52 ℃ 45 s；72 ℃ 50 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min,4 ℃冷卻。PCR 產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。經(jīng)Alphaease 凝膠成像系統(tǒng)掃描攝像測量灰度值。

1.3.2Western Blot法檢測新鮮浸潤性乳腺癌組織加入裂解液后冰上研磨，提取組織總蛋白，并應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(本實(shí)驗(yàn)用12%分離膠)。轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(poly vinglidene fluoride,PVDF)膜上，洗膜后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine,DAB)顯色。觀察并分析顯得結(jié)果。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法。每次免疫組織化學(xué)染色均設(shè)同步陽性和陰性對(duì)照(DIAPH-3陽性對(duì)照為宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織，陰性對(duì)照均用PBS代替一抗)。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1RT-PCR以人磷酸苷油酸脫氫酶(phosphogly cerate dehydro-genase，GADPH)為內(nèi)參，測定目的基因灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量=目的基因灰度值/GADPH灰度值。

1.4.2Western Blot以GADPH為內(nèi)參，測定目的蛋白灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GADPH灰度值。

1.4.3免疫組織化學(xué)SP法于光鏡下觀察，DIAPH-3 免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物均沿乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)線性分布，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，于胞漿內(nèi)也可見著色。于40倍物鏡鏡下隨機(jī)選取至少10個(gè)視野范圍或每個(gè)視野范圍至少200個(gè)細(xì)胞。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色顆粒為2分，棕褐色顆粒為3分。陽性細(xì)胞百分比標(biāo)準(zhǔn):陰性為0分，陽性細(xì)胞<10%為1分，10%～25%為2分，>25%～50%為3分，>50%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性。

2結(jié)果

2.1不同臨床病理特征 DIAPH-3蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示DIAPH-3蛋白表達(dá)率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)的增加而減少(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有脈管瘤栓患者的表達(dá)低于無脈管瘤栓患者(23.5%vs49.0%)(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有神經(jīng)受侵患者的表達(dá)低于無神經(jīng)受侵患者(19.4%vs45.3%)(P<0.01)；DIAPH-3 蛋白表達(dá)在不同年齡、不同組織學(xué)分級(jí)、不同腫瘤最大直徑、不同臨床分期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　浸潤性乳腺癌患者不同病理

*P<0.05與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較(χ2檢驗(yàn))

2.227例浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織中DIAPH-3 mRNA的表達(dá)RT-PCR 法和Western Blot 法均顯示，乳腺癌組織中的DIAPH-3表達(dá)均低于乳腺癌旁組織(P<0.01),見表2、圖1～2。

表2RT-PCR 和 Western Blot法檢測浸潤性乳腺癌組織和

癌旁組織中DIAPH-3的表達(dá)

Table 2Expression of DIAPH-3 protein in invasive breast

cancer and cancer adjacent tissues by RT-PCR and

Western Blot

組別RT-PCRWesternBlot乳腺癌組織 0.596±0.0940.233±0.086乳腺癌旁組織1.034±0.0960.941±0.249t 16.93913.965P 0.0000.000

圖1浸潤性乳腺癌癌及癌旁組織中DIAPH-3的RT-PCR表達(dá)

T.癌組織;NT.癌旁組織

Figure 1Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by RT-PCR

圖2浸潤性乳腺癌癌及癌旁組織中DIAPH-3的Western Blot表達(dá)

T.癌組織;NT.癌旁組織

Figure 2Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by Western Blot

2.3浸潤性乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤中DIAPH-3 蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示DIAPH-3蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)陽性率低于乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3　免疫組織化學(xué)法檢測DIAPH-3在浸潤性

2.4DIAPH-3與浸潤性乳腺癌預(yù)后Kaplan-Meier單因素生存分析顯示，DIAPH-3 蛋白表達(dá)水平降低與患者5年生存率降低有關(guān)，36例DIAPH-3表達(dá)陽性的患者較64例DIAPH-3表達(dá)陰性的患者5年生存率高(P<0.05)，見表4。

2.5Cox多因素生存分析DIAPH-3蛋白表達(dá)減少與預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，可以作為判斷浸潤性乳腺癌患者預(yù)后的影響因素，見表5，6。

表4　不同DIAPH-3表達(dá)浸潤性乳腺癌5年生存率比較

表5　Cox多因素分析的賦值

表6　影響浸潤性乳腺癌預(yù)后的Cox回歸分析

3討論

DIAPH-3 蛋白屬于Formin 蛋白家族，具有促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微絲的繼續(xù)伸長等作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分化、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、囊泡運(yùn)輸?shù)冗^程[1-6]。有研究證實(shí)，DIAPH-3基因的沉默使不穩(wěn)定的微管蛋白生成，誘使細(xì)胞內(nèi)吞作用障礙，激活下游Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路[7]。同時(shí)，DIAPH-3可以與Rho激酶結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、黏附、浸潤、分化等過程[8]。研究表明，DIAPH-3在細(xì)胞侵襲中扮演重要角色。DIAPH-3沉默在前列腺癌或其他類型細(xì)胞中導(dǎo)致了由干細(xì)胞向變形細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也引起了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲[9]。

DIAPH-3基因的沉默阻止細(xì)胞的樹突狀偽足樣運(yùn)動(dòng)、侵襲及基底膜的降解，通過改變膠原蛋白Ⅰ的構(gòu)型，DIAPH-3的沉默行為促進(jìn)了細(xì)胞侵襲。在Hela細(xì)胞中觀察到DIAPH-3基因的沉默阻礙細(xì)胞出胞過程，且有利于細(xì)胞的爬行[10]。然而DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)還鮮有研究。

本研究RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中mRNA及蛋白表達(dá)均低于乳腺癌旁組織。100例不同臨床病理特征的浸潤性乳腺癌組織免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，DIAPH-3表達(dá)減弱或缺失與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓出現(xiàn)、神經(jīng)受侵有關(guān)，提示DIAPH-3表達(dá)減弱或缺失可能誘導(dǎo)浸潤性乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移；而DIAPH-3表達(dá)減弱與浸潤性乳腺癌臨床分期和組織學(xué)分級(jí)無關(guān)。根據(jù)此結(jié)果推測有2種可能：①經(jīng)Cox多因素生存分析，DIAPH-3為預(yù)后的影響因素，提示DIAPH-3蛋白可能為貫穿浸潤性乳腺癌整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程的作用因子，其作用并不依賴于其他因素，獨(dú)立影響腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移；②在浸潤性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在與DIAPH-3蛋白拮抗的因素。

本研究Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示DIAPH-3與浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)；Cox多因素生存分析顯示DIAPH-3為浸潤性乳腺癌預(yù)后的影響因素，提示檢測患者組織內(nèi)的DIAPH-3表達(dá)，有助于臨床對(duì)于患者預(yù)后的評(píng)價(jià)和治療。然而在浸潤性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中，DIAPH-3的缺失與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機(jī)制有待進(jìn)一步的觀察證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Hager MH,Morley S,Bielenberg DR.DIAPH3 governs the cellular transition to the amoeboid tumour phenotype[J].EMBO Mol Med,2012,4(8):743-760.

[2]Gorelik R,Yang C,Kameswaran V,et al.Mechanisms of plasma membrane targeting of forming mDia2 through its a minoterminal domains[J].Mol Biol Cell,2011,22(2):189-201.

[3]BadvinacúCrnjevic T,Jakie-Razumovic J,Podolski P,et al.Significance of epidermal growth factor receptor expression in breast cancer[J].Med Oncol,2011,28(Suppl 1):S121-128.

[4]Manchaiah VK,Zhao F,Danesh AA,et al.The genetic basis of auditory neuropathy Spectrum disorder(ANSD)[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2011,75(2):151-158.

[5]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the formin DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res,2012,22(4):728-745.

[6]Sch?nichen A,Geyer M.Fifteen formins for an actin filament: a molecular view on the regulation of human formins[J].Biochim Biophys Acta,2010,1803(2):152-163.

[7]Hager MH,Morley S,Bielenberg DR.DIAPH3 governs the cellular transition to the amoeboid tumour phenotype[J].EMBO Mol Med,2012,4(8):743-760.

[8]Vorstman JA,van Daalen E,Jalali GR,et al.A double hit implicates DIAPH-3 as an autism risk gene[J].Mol Psychiatry,2011,16(4):442-451.

[9]Kim J,Morley S,Le M,et al.Enhanced shedding of extracellular vesicles from amoeboid prostate cancer cells: potential effects on the tumor microenvironment[J].Cancer Biol Ther,2014,15(4):409-418.

[10]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the forming DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res 2012,22(4):728-745. VK,Zhao F,Danesh AA,et al.The genetic basis of auditory neuropathy Spectrum disorder(ANSD)[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2011,75(2):151-158.

[5]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the formin DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res,2012,22(4):728-745.

[6]Sch?nichen A,Geyer M.Fifteen formins for an actin filament: a molecular view on the regulation of human formins[J].Biochim Biophys Acta,2010,1803(2):152-163.

[7]Hager MH,Morley S,Bielenberg DR.DIAPH3 governs the cellular transition to the amoeboid tumour phenotype[J].EMBO Mol Med,2012,4(8):743-760.

[8]Vorstman JA,van Daalen E,Jalali GR,et al.A double hit implicates DIAPH-3 as an autism risk gene[J].Mol Psychiatry,2011,16(4):442-451.

[9]Kim J,Morley S,Le M,et al.Enhanced shedding of extracellular vesicles from amoeboid prostate cancer cells: potential effects on the tumor microenvironment[J].Cancer Biol Ther,2014,15(4):409-418.

[10]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the forming DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res 2012,22(4):728-745.

(本文編輯：許卓文)

·論著·

·論著·

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第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事小兒肝膽疾病超聲診斷研究。

[中圖分類號(hào)]R737.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)07-0792-05

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-03-09 2015-01-19；[修回日期]2015-02-02

[基金項(xiàng)目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20120016) 河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(ZL20140026)

[作者簡介]李國慧(1976-)，女，河北井陘人，河北省兒童醫(yī)院主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。 劇紅娟(1982-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)

*通訊作者。E-mail：zhangtongdiyouxian@163.com

Expression of DIAPH-3 protein and prognosis in invasive breast cancer

TIAN Zhi-hui1,WANG Dan2,CAO Yan-kun3,MA Li4，ZHU Long5,LIU Yue-ping2*

(1.Department of CT,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;

2.Department of Pathology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,

China;3.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050011,China;4.Breast Center,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Hebei Breast Center,Shijiazhuang 050011,China;5.Department of

CT/MRI,the Hospital of Anguo City,Hebei Province,Anguo 071200,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer,then to explore the relationship between protein expression and clinicopathological features of invasive breast cancer as well as prognosis.MethodsmRNA and protein expression of DIAPH-3 in 27 cases of invasive breast cancer and cancer adjacent tissues were examined by RT-PCR and Western Blot.Immunohistochemical SP method was used to examine the expression of DIAPH-3 protein in 100 cases of invasive breast cancer.The clinical data were analyzed and the overall survival of the patients was followed up by telephone.ResultsThe mRNA and protein expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer were significantly lower than those of cancer adjacent tissues(P<0.01).The invasive breat cancer tissure showed the features:more number of lymph node metastasis,vascular vessel with tumor bolts,lower DIAPH-3 positive in invasive nerve.The decreased expression of DIAPH-3 associated with lower five-year survival rate of patients.Multivariate analysis showed that the expression of DIAPH-3 significantly related to survival(P<0.05).ConclusionThe expression of DIAPH-3 related to the prognosis of invasive breast cancer,and the item can be a biological indicator to evaluate the prognosis of invasive breast cancer.

[Key words]breast neoplasms;genes;DIAPH-3;prognosis